醫(yī)學教程 蛋白質的變性

第六節(jié)：蛋白質的性質12/15/20241一、蛋白質性質：

膠體性質(p299)

兩性性質及等電點

(p291)

蛋白質的變性、復性、沉淀和凝固

(p233,300)

蛋白質的紫外吸收

蛋白質的分子量

(p291)

蛋白質的呈色反應

二、蛋白質含量測定法(p315)12/15/20242蛋白質分子量大，它在水溶液中所形成的顆粒直徑約為1－100nm。膠體溶液具有布朗運動、丁達爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白質不能透過半透膜的性質，可以對蛋白質進行純化，這是提純蛋白質的一種常用方法。(一)膠體性質12/15/20243在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體的因素極性不電離基團：形成水化層極性電離基團：形成雙電子層原因12/15/20244

(二)兩性性質及等電點PrCOO-NH3+pH=pI凈電荷=0Isoelectricpoint(pI)定義：

在某一pH值溶液中，Pr酸性基團和堿性基團的解離程度相當,Pr分子所帶正負電荷相等，凈電荷為零,在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該蛋白質的pI。pH>pI凈電荷為負PrCOO-NH2OH-H+pH<pI凈電荷為正PrCOOHNH3+OH-H+12/15/20245

蛋白質和氨基酸一樣，是兩性電解質。在蛋白質分子中，可解離基團除了肽鏈末端的α-氨基和α-羧基外，主要的還是肽鏈上氨基酸殘基的一些側鏈基團，如：

ε－NH2、γ－COOH、β-COOH、咪唑基、胍基、－OH等。12/15/2024612/15/20247

pH=pI時，凈電荷為零，在電場中不移動

pH＞pI時，凈電荷為負，在電場中向陽極移動

pH＜pI時，凈電荷為正，在電場中向陰極移動

在pI時，蛋白質失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用。所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀.

12/15/20248（三）蛋白質的變性、復性、沉淀和凝固2.復性1.變性3.沉淀和凝固定義變性因素變性實質變性蛋白質的特點

變性的分類定義沉淀類型12/15/20249吳憲教授1931年：“天然Pr分子借助次級鍵連接而成一種緊密，有規(guī)則的空間結構，變性作用使次級鍵破壞從而使結構松散”。1.蛋白質的變性(denaturation)(1)定義：在某些理化因素的作用下，蛋白質嚴格的空間結構（不包括肽鍵）被破壞，從而引起若干理化性質改變和生物學功能喪失的現(xiàn)象。12/15/202410變性因素物理因素高溫、高壓紫外線、X射線、電離輻射和超聲波等化學因素有機酸、生物堿有機溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等12/15/202411變性實質：破壞了空間結構，一級結構不受影響（分子組成、MW不變）。12/15/202412變性蛋白質的特點①生物學活性喪失②理化性質改變③易被蛋白酶水解

空間結構改變旋光性、光吸收改變等溶解度↓，沉降率↑粘度↑擴散速度↓12/15/202413變性分類可逆變性:

Pr變性后如將變性劑除去，該Pr分子的天然構象和生物學活性還能恢復，這一過程稱為復性（renaturation）不可逆變性：若變性條件強烈，作用時間長，構像變化大，理化性質難以恢復。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。應用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……12/15/202414HOCH2CH2SH

ONH2-C-NH2=

NH2+

NH2-C-NH2=UreaGuanidineHClMercaptoethanolCl-SDSSO4-

-(CH2)11CH3常見的蛋白質變性劑JuangRH(2004)BCbasics12/15/202415極性頭部非極性尾巴SDS是一種表面活性劑sodiumdodecylsulfateStryer(1995)Biochemistry(4e)p.27512/15/202416SDS在蛋白質表面均勻鋪上一層負電荷SDSboiling變性蛋白質成一線狀分子自然狀態(tài)蛋白質並且均勻帶上一層負電荷JuangRH(2004)BCbasics12/15/20241712/15/202418核糖核酸酶變性與復性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復性12/15/202419去除變性因素后，變性蛋白恢復原來的空間結構，恢復生物活性的現(xiàn)象。本質—一級結構決定高級結構2.復性（renaturation）12/15/202420變性蛋白質為什么能復性？

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質的一級結構能夠決定二、三、四級結構。變性蛋白質的二、三、四級結構雖然遭到破壞，但是一級結構仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質能卷曲折疊成為能量最低的構象，一般天然蛋白質正是具有這種能量最低的構象。12/15/202421加熱使蛋白質變性并凝聚成塊狀稱為凝固（coagulation）。因此，凝固的蛋白質一定發(fā)生變性。

What’scoagulationofprotein?12/15/202422

凝固：變性后的蛋白質由于疏水基團的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白質不一定都是變性后的蛋白質)，加熱等因素使蛋白質變性并凝聚成塊狀。總結：Pr變性、沉淀與凝固之間的關系變性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定變性變性Pr不一定凝固凝固的Pr一定變性3.沉淀與凝固沉淀：蛋白質分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱沉淀。12/15/202423

沉淀類型

①

PI法

②鹽析法

③

有機溶劑沉淀法④重金屬鹽沉淀蛋白質⑤生物堿、有機酸試劑沉淀蛋白質⑥加熱變性沉淀法⑦抗體對蛋白質的沉淀：12/15/202424機理：奪取蛋白質顆粒上的水化膜，降低溶液的介電常數(shù)12/15/202425++++++++--------++++++++--------蛋白質膠體顆粒的等電點沉淀

帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質（疏水膠體）帶負電荷的蛋白質（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）12/15/202426不可逆沉淀

在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀12/15/202427可逆沉淀在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。12/15/202428定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半飽和硫酸銨沉淀球Pr

飽和硫酸銨沉淀清Pr優(yōu)點：Pr不變性，常用。鹽析法（Saltingout)(p305)叫分段鹽析法12/15/202429蛋白質分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多H2O，鹽濃度高時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結合，沉淀。鹽析（（NH4）2SO4）12/15/202430分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶12/15/202431

大部分蛋白質均含有帶共軛雙鍵的Tyr、Phe和Trp。這三種AA在280nm

附近有特征性吸收峰。在此波長范圍，蛋白質的A280與其濃度成正比。利用這個性質，可以對蛋白質進行定量測定。此外，蛋白質的肽鍵在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白質濃度的測定(四）蛋白質的紫外吸收12/15/202432（五）蛋白質的分子量蛋白質的相對分子量蛋白質相對分子量在10000~1000000d之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。12/15/202433測定蛋白質分子相對質量的方法1.根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量2.滲透壓法：

3.沉降法：超速離心4.凝膠過濾法：5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：12/15/2024341.根據(jù)分子組成測定最小分子量

測定某一微量元素或某一氨基酸的含量如鐵原子或色氨酸，并假設蛋白質分子中只有一個鐵原子或一個色氨酸，即最低相對分子質量=鐵的原子量/鐵的百分含量牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200d，實際為69000d，含2個Trp×100=16700=最小M＝Fe分子量

Fe(%)55.80.335(實為16900馬心)如肌紅蛋白含0.335%的鐵12/15/2024352.據(jù)pr的滲透壓測蛋白質分子量

12/15/202436用一半透膜將pr溶液與純水隔開，當滲透壓達平衡時，測定其滲透壓，計算分子量：C：濃度（克/升）R：氣體常數(shù)（0.082升/大氣壓/克分子/K開氏溫度）T：絕對溫度（開氏溫度）

：以大氣壓表示的滲透壓ccTRMrp0lim?=12/15/202437

優(yōu)點：滲透壓法簡單、準確(10000-100000d)、且不受蛋白質分子的形狀和水化程度影響不足：但受pH的影響，不能區(qū)別溶液中蛋白質分子是否均一

.12/15/202438

3、葡聚糖凝膠過濾法分析蛋白質分子量p297

12/15/202439

標準蛋白質（已知Mr和斯托克半徑）和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質不可用此法測定。12/15/2024404.SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳）12/15/202441

加入SDS和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對分子質量，而與電荷和分子形狀無關?！镉绊戇w移率的主要因素凝膠的分子篩效應對長短不同的棒形分子會產生不同的阻力〔主要因素〕凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質量大者，遷移率小★優(yōu)點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品

缺點：誤差大，約為±10％（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）★此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質量12/15/202442（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。+—-+12/15/202443等電聚焦電泳：當?shù)鞍踪|在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－12/15/202444沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s

=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s）

x=蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）超離心法是最準確可靠的確定蛋白質分子量方法。（Svedberg于1940年設計）：蛋白質顆粒在25~50×104g離心力作用下從溶液中沉降下來。3.超離心法12/15/202445蛋白質分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數(shù)（蛋白質分子量很大，離心機轉速很快，則忽略不計）V——蛋白質的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)12/15/202446

反應試劑顏色反應基團有此反應的Pr及AA雙縮脲反應

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2個以上肽鍵所有蛋白質Millon反應

Millon,硝酸，亞硝酸

紅色酚基Tyr黃色反應

HNO3及NH3

黃、橘黃

苯基Phe,Tyr乙醛酸反應乙醛酸H2SO4

紫紅吲哚Trp坂口反應

次氯酸鈉,萘酚紅色

胍基

ArgFolin酚試劑反應

CuSO4磷鎢酸-鉬酸

藍色

酚基Tyr茚三酮反應

茚三酮

紫藍色

游離氨、羧基Pro和羥Pro呈黃色（六）蛋白質的呈色反應12/15/202447二、Pr含量測定法

1.微量凱氏定氮法：2.雙縮脲法：3.福林-酚(Lowry)法

改良的Lowry法4.考馬斯亮藍法（Bradford法)5.紫外吸收法6.BCA法7.膠體金法12/15/202448

蛋白質含有多個肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反應，在堿性溶液中蛋白質與銅離子形成紫紅色絡合物，可在540nm比色測定，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸組成無關。

快速，但不很準確該法測定的蛋白質濃度范圍是

1～10mg/ml(g/L)雙縮脲法12/15/202449Lowry法

此法是對雙縮脲法的發(fā)展，首先在堿性溶液中形成銅與蛋白質的復合物，然后這種復合物及Tyr和Trp殘基還原磷鉬酸及磷鎢酸試劑(福林-酚試劑)，產生深藍色。

測定蛋白質的含量范圍：

500nm0.05～0.5mg/ml750nm0.03～0.3mg/ml12/15/202450改良Lowry法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應，生成藍色化合物，將其與雙縮脲法結合起來，形成兩種顏色的混合物，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25

g-250g/ml.

曾經的蛋白質濃度測定標準方法12/15/202451

考馬斯亮藍G250是一種帶有負電荷的染料，在酸性條件下可與蛋白質上的正電荷結合，形成藍色化物，在595nm具有特定吸收

本法反應快，操作簡單，靈敏度高，重復性好，消耗樣品少，但不同蛋白質之間的差異較大，且標準曲線線性較差。

測定范圍：0.01～1.0mg/ml考馬斯亮藍法（Bradford法)12/15/202452紫外吸收法

280nm和260nm吸收差法：

由于核酸在260nm具有光