基因工程教案

基因工程教案

第一章基因工程的主要技術(shù)

【教學(xué)目的】

讓學(xué)生掌握基因工程操作中常用的技術(shù)，包括常規(guī)技術(shù)生成原理，技術(shù)的應(yīng)用范

圍，技術(shù)的缺點(diǎn)等。使學(xué)生對基因工程的常規(guī)操作技術(shù)能夠了解并且學(xué)會(huì)應(yīng)用這

些技術(shù)設(shè)計(jì)、分析實(shí)驗(yàn)過程。

【教學(xué)重點(diǎn)】

分子雜交技術(shù)，PCR技術(shù)，DNA測序技術(shù)等等。

【教學(xué)難點(diǎn)】

Southernblot,PCR,DNA測序技術(shù)等等。

【教學(xué)方法】

多媒體演示與講解，啟發(fā)學(xué)生討論相結(jié)合。

【教學(xué)過程與教學(xué)內(nèi)容】：

第一節(jié)DNA提取與純化

由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的

提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。

一、質(zhì)粒DNA的提取

1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的原理

強(qiáng)堿使DNA變性，在復(fù)性的時(shí)候環(huán)狀的質(zhì)粒分子兩條單鏈沒離開，分子小，所以

復(fù)性快，而細(xì)菌染色體線性DXA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，

與蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。

1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA

（2）所用的試劑作用如下：

①溶菌酶：能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖昔鍵。

在堿性條件（pH>8）下有活性。

②葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用

而降解。使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)沉到管底部

③EDTA:Mg2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被晦降解。

@NaOH-SDS:NaOH：使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變形，溶解細(xì)胞膜。使DNA雙鏈變性。SDS:與

蛋白質(zhì)結(jié)合成〃蛋白一SDS〃復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。

⑤KAc-HAc緩沖液

溶液中的K+置換了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS,由于基因組DNA很長，

容易被PDS共沉淀。pH4.8醋酸用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性，以免長時(shí)

間的堿性條件使DNA斷裂。

⑥乙醇

DNA分子以水合狀態(tài)〃溶于〃水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。用于沉淀DNA。

⑦RNaseA

提取后的DNA中含有小分子的RNA,降解RNA渣滓。

⑧TE緩沖液

DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩

沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。

（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

第一步：溶菌

使用〃溶液I〃溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。

50mM葡萄糖，

25mMTris-HCl（PH8.0）,

10mMEDTA,

4-5mg/ml溶菌酶，

RNaseA

第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性

溶液口破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。0.2NNa0H,1.0%SDS

第三步：中和

溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。3M醋

酸鉀（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）

第四步：離心除去沉淀

第五步：純化DNA

上清液過柱或酚-氯仿抽提。

第六步：沉淀DNA

0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。

2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素

菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。

（1）受體菌株

一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、川109、XLl-Blue

等。endA基因編碼核酸內(nèi)切酶I,在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的

寡核甘酸片斷。

（2）質(zhì)粒拷貝數(shù)

二、基因組或其他DNA的提取

1.細(xì)菌基因組DNA的制備

2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提

3.從植物組織中制備DNA

三、DNA的定量和純度測定

1.紫外光譜法

DNA（或RNA）在260rlm波長處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（101）

在紫外分光光度計(jì)直接測定。

四、DNA分子量的估計(jì)

DNAladder

第二節(jié)凝膠電泳技術(shù)

一、瓊脂糖凝膠電泳的原理

在電場的作用下，DNA分子在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。

前者由DNA

分子所帶電荷量的多少而定，后者則主要與DNA分子的大小與構(gòu)型有關(guān)。DNA分

子在帶負(fù)電荷的緩沖液中向正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與其

分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系，大分子量的DNA在電用時(shí)比小分子的DNA移動(dòng)慢，

這樣可將不同大小的DNA分開。如將己知含有不同大小DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電

泳對照，那么可以在電泳后估計(jì)或計(jì)算出待測樣品的分子質(zhì)量。

二、瓊脂糖凝膠電泳

1.瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖在

水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“陳〃。瓊

脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高空隙小.

3.瓊脂糖凝膠的分辨力

空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎?，分辨率高：小分子較易通過，

而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。

DNA分子大?。?.1-60KB）

瓊脂糖凝膠的濃度

電泳緩沖液

電壓

電泳時(shí)間

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合

成凝膠，控

制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。區(qū)分范圍:0.001

—lkb之間。

聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel,型號從P-2至P-300共10種

聚丙烯酰胺凝膠的應(yīng)用：

SSCP,SNP,DNA測序,蛋白質(zhì)分離.

四、凝膠染色

EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光

照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA

含量及大小成正比。

DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳用硝酸銀染色。硝酸銀中的銀離子被DNA分子吸附在

表面，成為一種復(fù)合物，銀離子經(jīng)還原成為銀顆粒而顯現(xiàn)出褐色的條紋。AgN03

染色，NaOH和甲醛顯色。最后Na2c03終止顯色。

第三節(jié)核酸雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)，它主要是根據(jù)兩條單鏈DNA（或DNA與RNA）中互補(bǔ)堿基序列能

專一配對的原理進(jìn)行的。在一定條件下，單鏈DNA或RNA能與另一條單鏈DNA

上互補(bǔ)的堿基形成氫鍵，從而使兩條單鏈雜交形成雙鏈DNA分子。通常利用己標(biāo)

記的某一DNA或RNA片段或合成一段寡核甘酸作為探針，探測重組DNA分子中是

否有DNA片段與探針發(fā)生同源性雜交，然后利用放射自顯影方法進(jìn)行檢測。

一、探針的準(zhǔn)備

（一）探針類型

基因組DNA或RNA

人類染色體DNA片段，或外源DNA片段

體外轉(zhuǎn)錄的cRNA或cDNA

mRNA

（-）探針標(biāo)記

同位素標(biāo)記

非放射性標(biāo)記

直接標(biāo)記：酶，熒光素直接與探針相連

間接標(biāo)記：探針接抗原，檢測物接抗體

（三）探針標(biāo)記方法

缺口轉(zhuǎn)譯法

寡核甘酸標(biāo)記法

末端標(biāo)記法

PCR法

（四）探針必須滿足的條件

單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）足夠長度（至少12個(gè)堿基）內(nèi)

部不含互補(bǔ)區(qū)

二、Southern雜交

Southern印跡轉(zhuǎn)移試驗(yàn)（Southernblot）又稱凝膠電泳壓臼雜交技術(shù)，是

Southern于1975

年建立的一種DNA轉(zhuǎn)移方法。該法利用硝酸纖維素膜或經(jīng)特殊處理的濾紙或尼龍

膜具有吸附DNA的功能，先作DNA片段的凝膠電泳，并將凝膠電泳中的DNA區(qū)帶

吸附到膜上，然后直接在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記核酸探針與被測樣品之間的雜交，

再通過放射自顯影對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測。

Southernblot不僅可以定位地確定DNA中的特異序列，而且還可根據(jù)DNA片段

在凝膠中的泳動(dòng)距離，確定特異DNA片段分子量的大小及其含量。在進(jìn)行

Southernblot時(shí)，先以限制性內(nèi)切酶消化待檢的DNA片段，然后進(jìn)行瓊脂糖凝

膠電

泳。電泳完畢后，將凝膠放入堿性溶液中，使DNA雙鏈變性，解離為兩條單鏈。

再在凝膠上貼蓋硝酸纖維素膜，使凝膠上的單鏈DNA區(qū)帶按原來的位置吸印到膜

上。再將此膜置于含有同位素標(biāo)記的核酸探針的雜交液中感作反應(yīng)。按照堿基配

對原理，如果被檢DNA片段與核酸探針具有互補(bǔ)序列，就能在被檢DNA的區(qū)帶部

位結(jié)合成雙鏈的雜交分子，再通過放射自顯影顯示出來。

DNA雜交的流程：

1DNA電泳

2轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜時(shí)要凝膠底面朝上，上蓋硝酸纖維素膜

3探針與膜變性

4預(yù)雜交

5雜交

6洗膜

7放射自顯影檢測

三、Northern雜交

Northern吸印雜交試驗(yàn)（Northernblot）又稱為RNA印跡法，是對應(yīng)于Southern

blot而

命名的。它的特點(diǎn)是電泳結(jié)果為RNA圖譜而不是DNA圖譜，即是將RNA樣品通過

瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用同位素或生物素標(biāo)

記的DNA或RNA特異探制針對固定于膜」.的mRNA進(jìn)行雜交，洗脫除去非特異

性雜交信號，對雜交信號進(jìn)行分析，以確定目的基因的表達(dá)組織。操作方法大體

上是，先提取總RNA或mRNA,在強(qiáng)變性劑如甲基汞或甲醛存在條件下（防止RNA

形成二級結(jié)構(gòu)環(huán)），進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將膠上分離開的RNA吸印到

化學(xué)處理過的紙或硝酸纖維膜上，用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，然后作放射自

顯影，這樣可以在分子大小上將mRNA與相應(yīng)克隆的cDNA進(jìn)行比較。Northern

印跡轉(zhuǎn)移的結(jié)果一方面可以用于確定克隆的cDNA是否達(dá)到mRNA的全長，另一方

面可以確定外源基因或內(nèi)源基因在不同組織或不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。

四、菌落（嗜菌斑）原位雜交

噬菌斑雜交法的基本步驟是將重組噬菌體感染的宿主菌倒在平皿上，待生成噬菌

斑后，將

與培養(yǎng)皿一樣大小的硝酸纖維素薄膜蓋在上面，每個(gè)噬菌斑中約105個(gè)噬菌體就

影印轉(zhuǎn)移到膜上。膜揭下后，用堿處理除去蛋白質(zhì)外殼，使噬菌體DNA變性并

同膜共價(jià)結(jié)合，然后用同位素標(biāo)記的探針與之雜交，放射自顯影檢測。按照膜與

培養(yǎng)基上預(yù)先做好的方法標(biāo)記，將陽性噬菌斑挑出來擴(kuò)增。

五、Western雜交

Westernblot是指經(jīng)過SDS分離（聚丙烯酰胺凝膠電泳）的蛋白質(zhì)樣品，

轉(zhuǎn)移到固

相載體（如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保

持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為

抗原與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與醉或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底

物顯色或放射自顯影以檢查電泳分離的特異性的目的基因的表達(dá)的蛋白成分。

Westernblot的操作流程通常是：首先進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，

用考馬斯亮

藍(lán)染色，檢查蛋白質(zhì)分離的效果；然后在電場作用下進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，把膠上的蛋白

質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；纖維素膜用10%小牛血清BSA封閉30分鐘，以封閉

未吸附蛋白質(zhì)的部位，再將纖維素膜與第一抗體溫育，沖洗后再封閉；接著與酶

標(biāo)第二抗體溫育，最后加入酶促底物顯色。

第四節(jié)PCR技術(shù)

一、PCR技術(shù)的基本成分

1模板DNA

2一對引物

3dNTPs

4TaqB

5緩沖液

6Mg2+

7超純水

二、PCR技術(shù)的原理和過程

PCR叫多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是利用堿基互補(bǔ)配對的原則，在體外快速擴(kuò)增DNA的一

種方法。首先，分別在待復(fù)制的已知序列DNA分子兩端各設(shè)計(jì)一條引物，其中在

DNA5'端的引物(P1)對應(yīng)于」.鏈DNA單鏈的序列，3'端的引物(P2)對應(yīng)于下鏈

DNA單鏈的序列，P1和P2按5'-3'方向相向配置。然后在含有引物、DNA合成底

物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4種脫氧核糖核甘酸等摩爾數(shù)混合物)的緩

沖液中，通過高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復(fù)性，使引物

與模板DNA配對，利用耐熱的DNA聚合酶便可以合成產(chǎn)物DNA。若引物和dNTPs

過量，則在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使

產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的

模板DNA參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增。

三、PCR反應(yīng)程序：

1=94°

C2min

2=94°

C30sec

3=55-65°

C30sec

4=72°CImin

5=Goto2,30

cycles

6=72°

C5-10min

Holdat4°C

四、提局PCR特異性反應(yīng)的因素：

1特異性模板

2高退火溫度

3較低濃度引物、酶和Mg2+

4較少的循環(huán)數(shù)

5較純的模板與引物(無蛋白酶、DNA酶與EDTA污染)

五、PCR技術(shù)的擴(kuò)展：

1巢式PCR：設(shè)計(jì)內(nèi)外兩對引物同時(shí)擴(kuò)增目的基因片斷，提高反應(yīng)的特

異性。

2不對稱PCR(asymmetricPCR)：不對稱擴(kuò)增，兩條引物濃度50T00：

1，所以主要擴(kuò)增一條鏈。

3反向PCR(inversePCR)：擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列。

4多重PCR(multiplexPCR)：同時(shí)設(shè)計(jì)幾對引物擴(kuò)增同一條DNA鏈

5逆轉(zhuǎn)錄PCR（retrotranscriptionPCR：RT-PCR）：以RNA為模板的

PCR

6熒光定量PCR：通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探制，對PCR產(chǎn)物

進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析。

六、熒光定量PCR：

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)

控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析。

標(biāo)記方法：

1.內(nèi)插染料（SYBRgreenI）

2.雙標(biāo)記探針（5端標(biāo)記熒光分子，3端標(biāo)記吸收或淬滅熒光的分子）

3.分子信標(biāo)：同上，雙標(biāo)記，自身環(huán)化時(shí)檢測不到熒光，線性時(shí)熒光逐漸加強(qiáng)

熒光定量PCR實(shí)時(shí)定量分析的優(yōu)點(diǎn)：

①全封閉的PCR過程，無需跑膠，無需后處理；

②采用dUTP-UNG酶放污染，有效降低污染機(jī)會(huì)；

③實(shí)時(shí)在線監(jiān)控，對樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，實(shí)時(shí)觀察產(chǎn)物的增加，

直觀看到反應(yīng)的對數(shù)期；

④降低反應(yīng)的非特異性，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了

PCR反應(yīng)的特異性；

⑤增加定量的精確性，在樣品擴(kuò)增反應(yīng)的最佳時(shí)段（對數(shù)期）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，不

是傳統(tǒng)的終點(diǎn)法；

⑥線性關(guān)聚.接.到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)和樣品的起始模板濃度之間具有線性關(guān)系；

⑦結(jié)果分析更加快捷方便。

第五節(jié)DNA序列分析

一、Sanger雙脫氧鏈終止法

原理：雙脫氧核糖核甘三磷酸（ddNTP）不會(huì)與正常的脫氧核糖核昔三磷酸（dNTP）

形成磷酸二酯鍵，從而鏈的隨機(jī)終止；建立4個(gè)系統(tǒng)，就可得到4個(gè)套組（nested

sets）；在一個(gè)膠板上同時(shí)電泳，就可讀出模板鏈的互補(bǔ)鏈的順序。

特性：利用DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；其引物是帶有放射性標(biāo)記的，可通過

放射自顯影檢出；雙脫氧核糖核甘三磷酸（ddNTP）作為鏈終止劑；采用聚丙烯

酰胺區(qū)分長度僅差一個(gè)堿基的單鏈DNAo

2.技術(shù)要點(diǎn)

（1）制備單鏈DNA模板

（2）特殊的DNA多聚酶

①不能有5'?3'和3'?5'的外切酶活性；

②與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。

（3）制備2'和3'雙脫氧的ddNTP

（3）dNTP/ddNTP=100/1時(shí)，DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200

多個(gè)核甘酸序列。

制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）需帶有放射性或熒光標(biāo)記。

二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法

1將雙鏈或單鏈DNA經(jīng)過不同的化學(xué)方法降解，得到隨機(jī)的短的DNA片段，再通

過電泳分離讀取順序。

2每次只能在一個(gè)特定的核甘酸處降解：

G反應(yīng)：硫酸二甲脂（DMS）使鳥噂吟N7甲基化；

A+G反應(yīng)：甲酸使喋吟環(huán)上的氮質(zhì)子化導(dǎo)致糖昔鍵被削弱，進(jìn)而喋吟

環(huán)被喀咤取代；

C+T反應(yīng)：臟能夠裂解喀咤環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致其脫落；

C反應(yīng)：在一定濃度的條件下，朧只對胞喀咤起作用

三、DNA雜交測序

1原理：

90年代初期由英國、前南斯拉夫利俄羅斯的4個(gè)科學(xué)家小組同時(shí)提出來的。1）

只有完全互補(bǔ)的DNA序列才能雜交形成完全的雙鏈分子。雜交效率最高。（2）

有個(gè)別不互補(bǔ)堿基時(shí)，雜交效率下降。（3）非互補(bǔ)堿基越多，雜交效率越差。

2.技術(shù)要點(diǎn)

（1）DNA芯片（chip）

把寡聚核甘酸探針的3'端或5,端與玻璃或凝膠形成共價(jià)連接。目前可以做出

65536種8-mer探針芯片。每種探針的序列和位置己知，可被電腦讀出。

四、DNA自動(dòng)化測序

熒光物質(zhì)標(biāo)記。用激光能激發(fā)出不同顏色的熒光。Sanger脫氧終止法。激光探

頭直接讀膠，實(shí)時(shí)閱讀，電腦自動(dòng)把熒光信號轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的堿基，并打印出DNA

序列。反應(yīng)可在一個(gè)試管中進(jìn)行

【思考題】

1.Southernblot,Northernblot,Westernblot的區(qū)別和聯(lián)系是什么?

2.熒光定量PCR有哪些應(yīng)用？

3.巢式PCR有什么優(yōu)點(diǎn)？

4.基因芯片的應(yīng)用有哪些？

5.酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)如何？

6.構(gòu)建cDNA文庫需要用到哪些工具酶？

第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

基因工程的每一個(gè)關(guān)鍵步驟都需要特定的酶的參與?；驍U(kuò)增需要DNA聚合

酶；基因切割需要限制性核酸內(nèi)切酶；DNA片斷的連接需要DNA連接酶；DNA的

末端修飾需要DNA外切酶、多核甘酸激酶、堿性磷酸酶或末端轉(zhuǎn)移酶等等（表

3.1）o本章將簡要介紹和討論一些基因工程操作中常用的酶的性質(zhì)和用途以及

影響酶活性的條件和因素。

表31重組DNA實(shí)驗(yàn)中常用的若干種核酸酶

核酸酶名稱主要功能

II型核酸內(nèi)在特異性的堿基序列部位切割DNA分

切限制酶子

DNA連接將兩條DNA分子或片段連接成一個(gè)整

酶體

大腸桿菌通過向3,一端逐一增加核甘酸的方

DNA聚合酶式填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口

I

反轉(zhuǎn)錄以RNA分子為模板合成互補(bǔ)的cDNA

酶鏈

多核甘酸激把一個(gè)磷酸分子加到多核甘酸鏈的

酶5'-0H末端

末端轉(zhuǎn)移酶將同聚物尾巴加到線性雙鏈DNA分子

或單鏈DNA分子的3,-0H末端

核酸外切酶從一條DNA鏈的3,一端移去核苜酸殘

III基

1核酸外切催化自雙鏈DNA分子的T-端移走單

酶核甘酸，從而暴露出單鏈3,-端

堿性磷酸酶催化從DNA分子的5'-或3,-端或同

時(shí)從5,-和3,一端移去末端磷酸

S1核酸酶催化RNA和單鏈DNA分子降解成5,-

單核甘酸，同時(shí)也可切割雙鏈核酸分

子的單鏈區(qū)

Bal31酸酶具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，也

具有雙鏈特異的核酸外切酶活性

TaqDNA聚能在高溫（72℃）下以單鏈DNA為模

合酶板按5'-3,方向合成新生互補(bǔ)鏈

3.1DNA聚合酶

第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

DNA聚合酶（DNAPolymerase）在生物體內(nèi)以一條DNA鏈為模板合成另一條互補(bǔ)

DNA鏈。病毒、噬菌體、細(xì)菌以及哺乳動(dòng)物等不同門類的生物的DNA聚合酶種類

和結(jié)構(gòu)雖然不盡相同，但它們的DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是都需要一小段帶有3'

-0H的核酸引物（Primer）、4種dNTP、Mg*和單鏈DNA模板（Template）°基

因工程中常用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenowfragment、T7DNA

聚合酶、T4DNA聚合酶、修飾過的T7DNA聚合酶、耐高溫的DNA聚合酶（如Taq

DNA聚合酶）以及逆轉(zhuǎn)錄酶等（表3.2）。

表3.2基因工程中常用的DNA聚合酶極其特性比較

聚合

30-5050-30持續(xù)

反應(yīng)

聚合酶的名核酸外核酸外合成

速率

稱切酶活切酶活能力

性性

E.coliDNA

低有中速低

聚合酶I

KIenow大片.

低無中速低

段酶

反轉(zhuǎn)錄酶無無低速中

T4DNA聚合

高無中速低

酶

.■＞，.

天然的T7高無快速

DNA聚合酶

化學(xué)修飾的

T7DNA聚合低無快速高

酶

遺傳修飾的

T7DNA聚合無無快速高

酶

TaqDNA爽合

無有快速高

酶

3.1.1大腸桿菌DNA聚合酶I（PolI）

大腸桿菌中有三種不同類型的DNA聚合酶，即DNA聚合酸I、DNA聚合酶1【

和DNA聚合酶III,它們分別簡稱為PolI、PolII和PolHL其中PolI和Pol

II的主要功能是參與DNA的修復(fù)過程，而PolIII的功能是進(jìn)行DNA復(fù)制。在這

三種DNA聚合酶中，PolI在基因工程中最為有用，主要被用來制作核酸雜交用

的DNA探針（Probe）。

3.1.1.1大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)

大腸桿菌DNA聚合酶1是由大腸桿菌ploA基因編鳥的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，

分子量為109義10%@1/0]I酶有三種不同的酶催化活性，即位于N端的5C-3C

的核酸外切酶活性、5c-3,的聚合酶活形和較弱的3c-5,的核酸外切醮活性。

3.1.1.2大腸桿菌DNA聚合酶I的反應(yīng)條件

大腸桿菌DNA聚合酶I與其它DNA聚合酶一樣，也需要DNA模板和帶有3,

-0H的引物以及dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）底物。另外還需要Mg工

3.1.1.3用腸桿菌DNA聚合酶I制備探針

大腸桿菌DNA聚合酶I在基因工程中的主要用途是制作核酸雜交用的DNA探

針。探針是指能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，并帶有標(biāo)記的寡聚核

酸分子。標(biāo)記可以是放射性同位素或非放射性物質(zhì)，標(biāo)記可以在探針序列的5,

端或3'端，也可以是在其他區(qū)域甚至探針的全長。

利用DNA聚合酶I同時(shí)具備5,一3,外切酶活性和5,一3,的聚合酶活性

的特點(diǎn)制備DNA探針的方法稱為切口平移法（Nicktranslation）。首先在雙鏈

DNA分子的一條單鏈上用DNaseI制造一個(gè)切口（僅磷酸二脂鍵被切斷），DNA

聚合酶I的5c-3婿亥酸外切酶活性和聚合酶活性就可以同時(shí)在這個(gè)切口上發(fā)生

作用。當(dāng)外切酶活性從切口的人-側(cè)切去一個(gè)5M亥甘酸之后，聚合作用就會(huì)在

缺口的3廿側(cè)的-0H上延伸補(bǔ)上一個(gè)新的核甘酸。這樣5/側(cè)的核甘酸不斷地被

移去，3k側(cè)的核甘酸又按順序增補(bǔ)，于是切口便沿著DNA分子按合成的方向移

動(dòng)（圖3.1）。如果底物dNTPs中的某一種dNTP是帶有放射性標(biāo)記的話（如Q

-32P-dNTP）,新增補(bǔ)上的DNA片斷就會(huì)帶有放射性，可用作探針。

3.1.2Klenow片段

用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶【可以切掉其N端的5'—3'外

切醮活性部分（36KDa）,余下的76KDa具有全部的5'-3'聚合酶活性和制

f5c的核酸外切酶活性，這個(gè)片段被稱為Klenowfragment,又叫做Klenow聚

合酶或Klenow大片段酶。由于喪失了5'-3'外切酶活性，Klenow聚合酶不能

像其母體DNA聚合酶I那樣以獨(dú)特的切口平移方式標(biāo)記DNA探針。在基因工程操

作中，Klenow聚合酶的主要月途是填補(bǔ)單鏈缺口、補(bǔ)平雙鏈DNA經(jīng)限制性內(nèi)切

酶切割后形成的靠隱蔽末端、標(biāo)記DNA片段的3'末端以及合成cDNA的第二鏈

（圖3.2）o

圖3.2Klenow片段，只填補(bǔ)缺口

多數(shù)限制性內(nèi)切酶切割DNA雙鏈后形成的末端不是齊平末端，而是交錯(cuò)斷開

的粘性末端。其中有些是5'瑞隱蔽而3'端突出的，有些是3'端隱蔽而5'端

突出的。對于后一種形式的末端，其隱蔽的3'-0H就能起到引物的作用，在DNA

聚合酶的作用下以突出的5'端單鏈部分為模板可被延伸直到與5'端齊平，稱

為3'補(bǔ)平。在補(bǔ)平的過程中，底物dNTPs中如果有一種或數(shù)種的帶有放射性或

非放射性標(biāo)記的脫氧核甘三磷酸（如有一種是在其Q-磷酸基團(tuán)具有32P標(biāo)記的

脫氧核昔三磷酸），用Klenow聚合酶延伸其3'隱蔽末端，帶有標(biāo)記的dNTP就

可能被摻入新延伸的單鏈3'末端中，完成DNA3'末端標(biāo)記（圖3.3）。以mRNA

為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成的單鏈DNA稱為cDNA第一鏈。然后就可以用Klenow聚合

酶以這條cDNA第一鏈為模板合成其互補(bǔ)DNA鏈，即cDNA第二鏈。

圖3.3DNA分子的末端標(biāo)記

(a)由EcoRI限制酶產(chǎn)生的DNA片段末端用a-32P-dATP標(biāo)記；

(b)BamHI限制酶產(chǎn)生的DNA片段末端用a-32P-dNTP標(biāo)記。*

號表示帶叩標(biāo)記的核甘酸

3.1.3T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是由T4噬菌體基因43編碼的，是從"噬菌體感染的大腸桿

菌培養(yǎng)物中純化出來的一種特殊的DNA聚合醐，具有3c的聚合酶活性和的

核酸外切酶活性。這一點(diǎn)類似大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段，因此T4DNA

聚合酶也可以用來標(biāo)記DNA隱蔽的30-末端。但像大腸桿菌DNA聚合酶I一樣,

T4DNA聚合酶在沒有脫氧核昔三磷酸(dNTPs)的條件下，3矽卜切酶活性也能從

3,端降解DNA雙鏈(或單鏈)，制造出3'隱蔽端。

如果反應(yīng)混合物中只有一種dNTP,降解到DNA3'端是這種dNTP的位置時(shí)就

會(huì)停止。當(dāng)反應(yīng)物中4中dNTPs都有時(shí)T4DNA聚合酶又可以像DNA聚合酶I或

Klenow片段那樣執(zhí)行聚合酶功能，以隱蔽的3,-0H為引物補(bǔ)平3,隱蔽端。因

此T4DNA聚合酶可以進(jìn)行3,隱蔽末端的補(bǔ)平并同時(shí)進(jìn)行末端標(biāo)記。在基因操

作中T4DNA聚合酶的獨(dú)特用途是用來對平端或5'隱蔽端雙鏈DNA進(jìn)行末端標(biāo)

記。首先在無dNTPs時(shí)利用T4DNA聚合酶的3?f5c外切酶活性作用于平端或5'

隱蔽端雙鏈DNA,制造出3'隱蔽末端。制造出的3'隱蔽末端起引物的作用。

然后再加入含有一種被標(biāo)記的dNTP(如a-32P-dNTP)的dNTPs。T4DNA聚合

酶的聚合作用又會(huì)將它所制造出的3'隱蔽末端補(bǔ)平，反應(yīng)物中的標(biāo)記dNTP會(huì)

被摻入新補(bǔ)平的末端中，結(jié)果看起來似原有的才端被取代為新合成的帶有標(biāo)記

的3'端，因此特稱為取代合成法(圖3.4)。

3.1.4T7DNA聚合酶

T7DNA聚合酶是從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基

組成：大亞基由T7基因5編碼，分子量為84kDa,本身具有DNA聚合酶和單鏈

的罪―5c外切酶活性。小亞基是一種硫氧還蛋白（thioredoxin）,由大腸桿菌

基因編碼，分子量為12kDa,功能是增加大亞基對模板的親和性。小亞基的存在

使T7DNA聚合酶持續(xù)合成DNA的能力非常強(qiáng)，它能夠在引物上延伸數(shù)千個(gè)核首

酸而不發(fā)生任何與模板解離現(xiàn)象，同時(shí)基本上也不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響。而這

類二維結(jié)構(gòu)則會(huì)阻礙大腸桿菌DNA聚合酶、T4DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶的活性。

因此T7聚合酶在合成大分子量DNA是很有用。T7聚合酶和T4聚合酶具有大體

相同的冢一5c核酸外切酶活性強(qiáng)度，所以如同T4DNA聚合酶一樣，T7DNA聚合

酶也可以通過單純的延伸或取代合成法標(biāo)記DNA的3c末端或補(bǔ)平3'隱蔽末端。

3.1.5修飾的T7DNA聚合酶

雖然T7DNA聚合酶具有極強(qiáng)的持續(xù)合成大片段DNA的能力，但其罪一5,核

酸外切酶活性也很強(qiáng)。用化學(xué)方法或遺傳手段對天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾,

使T7噬菌體的基因5蛋白的核酸外切酶區(qū)域失活，從而完全喪失3C-5c的核酸

外切酶活性，而聚合能力和速率卻進(jìn)一步增強(qiáng)。在基因操作中，修飾的T7DNA

聚合酶除具有像T4和天然T7DNA聚合酶一樣能被用來進(jìn)行3'隱蔽端補(bǔ)平和末

端標(biāo)記之外，還能有效催化脫氧核甘酸類似物（如雙脫氧甘酸，-代］脫氧核

甘酸及脫氧肌甘核甘酸等）摻入新合成的DNA鏈中，所以在雙脫氧法DNA測序中

有特殊的用途。

3.1.6反轉(zhuǎn)錄酶

以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶叫依賴于RNA的DNA聚合酶,也叫做RNA

指導(dǎo)的DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶（圖3.5）。

圖3.5反轉(zhuǎn)錄以RNA為模板指導(dǎo)和成DNA

從多種RNA病毒中都能分離出這種酶。目前基因工程中使用最普遍的是來源

于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（Avianmyeloblastosisvirus,AMV）的反轉(zhuǎn)錄酶。

它是由65kDa的□鏈和95kDa的P鏈組成的。其中a肽鏈具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和

RNasell活性。RNasell是由a多肽鏈經(jīng)蛋白酶水解切割之后產(chǎn)生的一種多肽片段

（分子量為24kDa）,是一種核糖核酸外切酶，它以5?f3c或3?f5C的方向特

異地降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈。P肽鏈則具有以RNA-DNA雜交分子為

底物的5c-3c脫氧核酸外切酶活性（圖3.6和圖3.7）°

圖3.6反轉(zhuǎn)錄酶5，f3,方向的DNA聚合酶活性

圖3.7反轉(zhuǎn)錄酶的5C-3C方向和常-5,方向的核糖核酸外切酶活性（RNaseH

活性）

反轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中最主要的用途是以mRNA為模板合成cDNAo雖然這種

酶同樣需要一段引物的存在，但由于真核生物絕大多數(shù)的mRNA3'端都有一段

PolyA,因此可以合成一段寡聚T（oligodT）與PolyA退火作為引物合成cDNA

第一鏈。也可以用隨機(jī)引物（Randomprimer）合成cDNA第一鏈。隨機(jī)引物是隨

機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷，理論上它能與各種序列的模板結(jié)合。用堿水解除去

mRNA后，單鏈cDNA能夠自我折疊形成一種發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（原因未知），它可供作

cDNA第二鏈合成的引物。用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成。

用SI核酸酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)就成了可供PCR擴(kuò)增的雙鏈DNA模板。

3.1.7耐高溫的聚合酶

在體外擴(kuò)增基因時(shí)需要高溫變性DNA雙鏈模板，然后用DNA聚合酶進(jìn)行DNA

合成。合成完畢后還要把新合成的DNA雙鏈再高溫變性，如此循環(huán)才能擴(kuò)增出大

量所需要的目的DNA,這就是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的基本思想。在不斷的高

溫變性循環(huán)中，每次都將會(huì)把加入的DNA聚合酶滅活，對酶造成極大的浪費(fèi)，增

加成本。因此迫切需要一種耐高溫的DNA聚合酶。

3.1.7.1TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從一種水生嗜熱真菌（Thermusaquaticus）yTl株分離提

取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94kDa,具有5?f3c聚合酶活性和5?f3助卜切

能活性，但沒有靠一5c外切醉活性。該菌是1969年從美國黃石國家森林公園火

山溫泉中分離的。這種酶在75?80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核昔

酸，70℃延伸率大于60個(gè)核甘酸/秒，55c時(shí)為24個(gè)核甘酸/秒。溫度過高（90℃

以上）或過低（22℃）都可影響TaqDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶雖然

在90c以上幾乎無DNA合成，但有良好的熱穩(wěn)定性。PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃

Imin,50個(gè)循環(huán)后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。TaqDNA聚合酶合成后的

DNA雙鏈不是平端，3,端常常有一個(gè)突出的堿基A,便于與k端有一個(gè)突出的

T的線性載體（『載體）直接連接，這是它的一大優(yōu)點(diǎn)。此外TaqDNA聚合酶還

具有逆轉(zhuǎn)錄活性，其作用類似逆轉(zhuǎn)錄酶。此活性溫度一般為65?68℃,有MrT

存在時(shí)，其逆轉(zhuǎn)錄活性更高。但TaqDNA聚合酶主要被用在PCR擴(kuò)增的高溫循環(huán)

條件中，因?yàn)檫@是普通DNA聚合酶所不能勝任的工作。

3.1.7.2PfuDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶也是一種熱穩(wěn)定性酸，分子量為92kDa,是從Pyrococcus

furiosus中分離的。該酶在75℃時(shí)可進(jìn)行DNA復(fù)制。與TaqDNA聚合酶不同的

是它除具有5C-3c聚合酶活性和5?f3c外切酶活性外，還具有3C-5c外切酶活

性。PfuDNA聚合酶的3'-5'外切酶（校正）活性可將錯(cuò)配的堿基切除，這是它

優(yōu)于TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)。此酶是目前己發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫的DNA聚合酶中出

錯(cuò)率最低的，因而PfuDNA聚合酶常用于高保真的PCR反應(yīng)和引物的延伸反應(yīng)。

但PfuDNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平端，無末端磷酸化。

3.2DNA修飾酶

在基因操作中經(jīng)常涉及到需要對擴(kuò)增出來的或切割得到的DNA片段的末端進(jìn)

行必要的修飾以便于連接或進(jìn)行其他特殊的反應(yīng)。無論是在3'端添加或降解核

昔酸還是在5,端磷酸化或去磷酸化，都需要特殊的酶催化反應(yīng)，這些酶被稱為

修飾酶。下面簡要介紹幾種基因工程中常用的DNA修飾酶的特性和用途。

3.2.1末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶

末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移

酶(Terminaldeoxynucleotidyltransferase)簡稱DNA末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal

transferase),是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量(34kDa)的堿性蛋白

質(zhì)，由分子量分別為26kDa和8kDa的大小亞基組成。這種晦具有5,一3CDNA

聚合酶活性，能夠催化將脫氧核甘酸分子逐個(gè)添加到線性DNA分子的常-0H末

端(圖3.8)。但與一般的DNA聚合酶不同，在反應(yīng)中需要二甲腫酸緩沖液。末

端轉(zhuǎn)移酶的另一個(gè)特性是不需要模板。底物可以是單鏈DNA、也可以是3'-0H

突出的雙鏈DNA、甚至平端雙鏈DNA在Co,-代替Mg’時(shí)也可以在3'-0H添加脫氧

核甘酸。由于不需要模板指導(dǎo)，4種dNTPs中的任何一種都可以被添加到3'端。

但當(dāng)反應(yīng)混合物中只有一種dNTP時(shí)，就可以形成僅由一種核甘酸組成的罪尾巴,

我們特稱這種尾巴為同聚物尾巴(Homopolymerictail)o這種方法在基因操作

中稱為同聚物加尾。即在需要連接的平端DNA3'末端分別添加上互補(bǔ)的核甘酸

同聚物尾巴（如一條DNA雙鏈3'端添加GGG,另一條添加CCC）,就形成了粘

性末端，便于連接。

末端轉(zhuǎn)移酶的另一個(gè)用途是被用來再生限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。如Hind

III的酶切位點(diǎn)序列是5'-AAGCTT-3',用Hindlll酶切開載體DNA后成為粘性末

端，再用Klenow片段補(bǔ)平未平端，即成為兩頭均有5'-AAGCTT-3'末端的開口

載體，然后用末端轉(zhuǎn)移醮催化加上同聚物尾巴。在將要連接的外源DNA片段兩頭

用末端轉(zhuǎn)移的加上互補(bǔ)同聚物尾巴，與載體連接。結(jié)果在外源插入片段的兩側(cè)各

有一個(gè)HindHI的酶切位點(diǎn)序列5'-AAGCn-3',這樣便于用HindHI酶切取下外

源DNA片段（圖3.9）。

除了上述用途外，末端轉(zhuǎn)移酶還可以用來對DNA進(jìn)行3'末端標(biāo)記。催化帶

有放射性標(biāo)記（如［Q32p］一3?-脫氧核甘酸）或非放射性標(biāo)方的脫氧核昔酸（如

生物素-11-dUTP,8-（2,4-二硝基苯-2,6-氨基乙基）氨基腺喋吟核昔

-5?一三磷酸［8-（2,4-dinitrophenyl-2,6-aminohexyl）aminoadenosine

-50-triphosphate］，或2c-脫氧尿喀咤核昔-5C-三磷酸-5C-烯酰胺生物

素（2C-deoxyuridine-50-triphosphate-50allylaminobiotin）添力口至3'

末端。

3.2.2T4多核昔酸激酶

T4多核甘酸激酶是由T4噬菌體的pseT基因編碼的?？蓮腡4噬菌體感染的

大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。現(xiàn)在在多種的晡乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這種激酶。T4

多核甘酸激酶能催化g磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5'-0H端使其

磷酸化，不論其T-0H端突出與否，也不受底物分子鏈的長短大小限制，即使

是單核甘酸也同樣適用。T4多核昔酸激酶的這一功能在基因操作中十分有用，

因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)DNA片段連接的時(shí)候是3'-0H與5'-P形成磷酸二脂鍵。5'端非磷

酸化的DNA參與連接時(shí)必須先用T4多核甘酸激酶把5'-0H磷酸化。此外當(dāng)使用

Y標(biāo)記的ATP作前體物時(shí)，多核甘酸激酶可以使底物核酸分子的5C-OH末

端標(biāo)記上丫一沖，實(shí)現(xiàn)末端標(biāo)記（圖3.10）。

圖3.10T4多核昔酸激酶的活性與DNA分子"-末端的標(biāo)記

3.2.3堿性磷酸酶

與T4多核甘酸激酶的作用相反，堿性磷酸酶能夠?qū)NA（或RNA）的5'-P

脫掉，使5,端也變成-0H（圖3.11）。我們在基因克隆的時(shí)候?yàn)榉乐馆d體互相

連接，常常先用堿性磷酸酶處理去掉5,-P使之不能與自身的3,-0H連接，但

其3'-OH仍然能與外源DNA插入片段上的5'-P連接上一條鏈。雖然兩條鏈由

于載體5,端被脫掉P而都不能完全連接，但這仍然能使重組載體保持環(huán)形結(jié)構(gòu),

轉(zhuǎn)入受體菌后未連接的切口會(huì)被受體菌修豆。

圖3.11堿性磷酸酶將DNA的5,磷酸脫掉

基因操作中常用的堿性磷酸酶有兩種來源：一種是從大腸桿菌中純化出來

的，叫做細(xì)菌堿性磷酸酶(Bacterialalkalinephosphatase,BAP),具有抗

熱性，不容易用加熱的辦法滅活溶液中的BAP。另一種是從小牛腸中純化出來的,

叫做小牛腸堿性磷酸酶(Calfintestinalalkalinephosphatase,簡稱CIP),

SDS中加熱68°C可完全失活，可以被簡單地加熱失活。而且CIP的比活性要比

BAP的高出10?20倍。因此，在大多數(shù)情況下都優(yōu)先選用CIP酶。

3.3核酸外切酶

在基因操作中，有時(shí)需要從某一個(gè)

末端開始沿一個(gè)特定的方向?qū)⒛骋欢蜠NA縮短。這就需要用到核酸外切酶。核酸

外切酶(Exonucleases)就是一類從多核甘酸鏈的一頭開始催化降解核甘酸的酶

(圖3.12)。按作用的底物特性，可分為單鏈核酸外切能和雙鏈核酸外切酸。

單鏈核酸外切酶消化單鏈核酸，如大腸桿菌核酸外切酶I(exoI)和核酸外切

酶vn(exovn)o雙鏈核酸外切酶，能消化雙鏈核酸，如大腸桿菌核酸外切酶in

(exoIII),X噬菌體核酸外切酶(Xexo)以及T7噬菌體基因6核酸外切酶等。

本節(jié)簡要介紹這幾種核酸外切酶的特性及其在基因操作中的用途。

3.3.1單鏈DNA外切酶

3.3.1.1大腸桿菌核酸外切酶I

大腸桿菌核酸外切酶I(exoI)識別單鏈DNA(ssDNA)的5'-0H,然后以

5C-3c的方向逐一切掉核昔酸。

3.3.1.2大腸桿菌核酸外切酶W

大腸桿菌核酸外切iWVn(exoVII)識別單鏈DNA(ssDNA)的3'-OH或5'

-P,將DNA切成212bp的寡核酸短片段，且不需要Mg"離子。

3.3.2雙鏈DNA外切酶

3.3.2.1大腸桿菌核酸外切酶DI

大腸桿菌核酸外切酶HI(exoIII)識

別雙鏈DNA(dsDNA)的3'-OH,然后以3，一5C的方向逐一切掉DNA鏈，釋放5c

-單核甘酸(圖3.13)o此外，核酸外切酶III還具有對AP位點(diǎn)(無喋吟位點(diǎn)及

無喀咤位點(diǎn))特異的核酸內(nèi)切酶活性、30-磷酸酶活性和RNaseH酶活性。RNaseH

酶活性，是降解DNA-RNA雜種核酸分子中的RNA鏈。核酸外切酶HI在基因操作

中的主要用途是通過其3C-5c外切酶活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出3'端隱蔽的單

鏈區(qū)。這樣就能用Klenow酶和放射性標(biāo)記的核甘酸制備特異的放射性探針。此

外由于核酸外切酶HI是雙鏈特異性的，從雙鏈DNA的兩個(gè)3'-0H開始以3'一

5'方向降解，在降解至DNA中部后將無雙鏈可降，形成兩條DNA單鏈，可以用

作DNA測序的模板。

3.3.2.21核酸外切酶(入exo)

入核酸外切酶是從感染了入噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的。這種酶識

別雙鏈DNA分子的5C-P末端，以解一3c方向逐步水解，釋放出屣單核甘酸，

但它不能降解50-0H末端。最終會(huì)把雙鏈DNA降解成兩條單鏈。

入核酸外切酶在基因操作中的用途與大腸桿菌核酸外切酶III類似，將雙鏈

DNA轉(zhuǎn)變成單鏈的DNA,為雙脫氧法進(jìn)行DNA序列分析提供單鏈模板。另外可制

造5,隱蔽末端從而突出3,-0H端，以便于在只有Mg"存在下用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行

同聚物加尾。

3.3.2.3T7基因6核酸外切酶

T7基因6核酸外切酶是大腸桿菌T7噬菌體基因6編碼的產(chǎn)物。這種核酸外

切酶既能識別雙鏈DNA的5'-P又能識別5C-OH,然后以5C-3c方向逐步水解

DNA,釋放出5c單核昔酸。因此T7基因6核酸外切酶同入核酸外切酶具有同樣

的用途。但它的加工活性要比入核酸外切酶的低。在表3-3中總結(jié)了本節(jié)中介紹

的核酸外切酶的特點(diǎn)。

表3.3若干種核酸外切酶的基本特性

底物DNA外切酶切割方式識別位點(diǎn)

單鏈DNA大腸桿菌核酸外切酶I(exoI)50-3050-OH

大腸桿菌核酸外切酶vn50-305，-P

(exoVII)30-503'-0H

雙鏈DNA核酸外切酶III(exoIII)30-503'-0H

入核酸外切酶(入exo)5—35,-P

T7基因6核酸外切酶5"35'-P

50-OH

3.4核酸內(nèi)切酶

在基因操作中更多的時(shí)候是需要從大片段的基因組中或從載體上將我們所

需要的基因片段切割下來。這種切割不是從DNA的某個(gè)末端開始，而是在一個(gè)大

片段的內(nèi)部制造一個(gè)或多個(gè)切口，將目的DNA片段分離出來。這就需要用到另外

一類非常重要的酶，稱為核酸內(nèi)切酶。核酸內(nèi)切酶按其所作用的底物特點(diǎn)也可以

分為單鏈核酸內(nèi)切酶和雙鏈核酸內(nèi)切酶。本節(jié)將主要介紹兒種基因操作中常用的

核酸內(nèi)切酶。

3.4.1單鏈DNA內(nèi)切酶

單鏈DNA內(nèi)切酶特異性地識別并從內(nèi)部切斷單鏈DNAo在基因操作中用途較

大的是S1核酸內(nèi)切酶和Bal31核酸酶。

3.4.1.1S1核酸內(nèi)切酶

S1核酸內(nèi)切酶是從稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）中純化來的，是一種高

度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶。這種酶的活性要求低Zr?離子濃度和pH4.0~4.3的范

圍。當(dāng)pH值上升到4.9時(shí)，降解速率會(huì)下降50%。在最適的酶催反應(yīng)條件下，

降解單鏈DNA的速率遠(yuǎn)比降解雙鏈DNA速率快（約75,000倍）。有些陽離子螯

合劑，如EDTA和檸檬酸等，能強(qiáng)烈地抑制S1核酸的活性。此外磷酸緩沖液和

0.6%左右的SDS也能抑制它的活性，但尿素和甲酰胺等試劑則影響很小。

S1核酸內(nèi)切酶的功能是切割單鏈RNA和單鏈DNA分子成為5c單鏈核甘酸。

另外它也能作用于雙鏈核酸分子中的單鏈區(qū)。如雙鏈DNA中的其中一條鏈上帶有

小缺口或其中一條鏈上存在由于不能互補(bǔ)配對而凸起的部分，S1核酸內(nèi)切酶能

從此處切斷核酸分子，即使這個(gè)單鏈區(qū)小到只有一個(gè)堿基對的程度（圖3.14）o

但S1核酸內(nèi)切酶不能降解天然構(gòu)型的雙鏈DNA和RNA-DNA雜種分子。

（i）對單鏈DNA的活性，切割單鏈的（ii）對帶有缺口或裂口的雙鏈DNA或

DNARNA的活性

圖3.14S1核酸酶的活性

S1核酸內(nèi)切酶在基因操作中的用途之一是降解由限制性內(nèi)切酶切割形成3'

或5,端突出的單鏈部分粘性末端，形成齊平末端。不過這一工作別的核酸酶也

能做到。在合成cDNA第二鏈時(shí)常利用cDNA第一鏈的3'端彎回來形成的發(fā)卡結(jié)

構(gòu)（原因不明）作為引物，S1核酸內(nèi)切酶獨(dú)特的用途是在cDNA第二鏈合成完畢

后將這個(gè)突出的單鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)切掉，以得到雙鏈cDNA。

其次由于S1核酸內(nèi)切酶能識別雜交雙鏈中因堿基不能互補(bǔ)配對而形成的突

出單鏈環(huán)，基因操作中就利用這一特性來定位真核基因的內(nèi)含子區(qū)域。真核生物

基因中含有不編碼的內(nèi)含子區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被剪切掉，相應(yīng)的外顯子

區(qū)的mRNA區(qū)拼接成成熟的mRNA。當(dāng)用mRNA與相應(yīng)的基因組DNA雜交時(shí)，DNA

中的外顯子區(qū)全部能與mRNA互補(bǔ)配對成雙鏈，而內(nèi)含子區(qū)DNA由于找不到與之

互補(bǔ)配對的mRNA而突出成為單鏈環(huán)。S1核酸內(nèi)切酶能切掉這一部分單鏈環(huán)，用

連接酶連接后測定剩下的雜種雙鏈中DNA的外顯子序列，與基因組中原基因序列

比較就能準(zhǔn)確知道內(nèi)含子的位置和序列。

另外利用S1核酸酶降解雜交鏈中的單鏈部分這一特點(diǎn)，也可以在精確測序

前初步判定mRNA在基因組DNA上的相對應(yīng)位置。首先在DNA上確定一個(gè)限制性

內(nèi)切酶位點(diǎn)作為參照，用該酶切后得到兩段DNA。將這兩段分別與相同的mRNA

雜交，不能雜交的DNA和RNA單鏈部分可以被S1核酸酶降解。把留下的雙鏈部

分電泳后，就能大概知道這茂個(gè)雙鏈部分的長度是多少bp。從而判斷出mRNA相

對于這個(gè)限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)的位置，即覆蓋了該切點(diǎn)上游多少個(gè)bp、下游多

少個(gè)bp或完全不包括這個(gè)酶切位點(diǎn)。

圖3.15利用S1核酸酶初步判斷mRNA在基因組DNA上的相對應(yīng)位置

3.4.1.2Bal31核酸酶

基因操作中用到的另一種單鏈核酸內(nèi)切酶是Bal31核酸酶。但這個(gè)酶同時(shí)也

具有雙鏈特異的核酸外切酶活性。它是從埃氏交替單胞菌（Alteromonas

espejiana）中分離出來的。其雙鏈核酸外切酶活性從冢和5c兩末端移去核甘酸

降解雙鏈DNA,單鏈內(nèi)切酶活性切斷雙鏈DNA上對應(yīng)于單鏈缺口的另一條鏈上未

配對的單鏈區(qū)域（圖3.16）,類似于S1核酸酶。

Bal31核酸酶的活性需要Ca?.和hkf離子，在反應(yīng)混合物中加入EGTA（乙二

醇雙四乙酸）便可終止它的活性。由于EGTA是Ca"離子的專門螯合劑，它不會(huì)

改變?nèi)芤褐蠱g"離子的濃度，因此能夠在不影響以后加入的需要卜靖,的核酸內(nèi)切

限制酶活性的情況下，終止Bal31核酸酶的作用，便于控制其降解進(jìn)度。

圖3.16Bal31核酸酶的活性

Bal31核酸酶在基因操作中的用途就是利用了EGTA能夠在不影響以后加入

的核酸內(nèi)切限制酶活性的情況下終止其作用這一便利之處，用Bal31控制消化法

來測定線性DNA片段上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)順序。用Bal31核酸酶消化一段DNA

雙鏈，并在間隔一定的時(shí)間段后加入EGTA終止其反應(yīng)，然后用某種限制性內(nèi)切

酶切割后電泳。將電用片段與未經(jīng)Bal31核酸酶消化的原始DNA片段的同一內(nèi)切

酶切割電泳圖譜對比就能推斷出雙鏈DNA片段經(jīng)Ba⑶核酸酶消化后兩頭逐漸消

失的酶切位點(diǎn)的順序。另外利用Bal31核酸酶這種可控制的雙鏈外切酶活性也可

以有目的地將某一基因的一頭縮短，制造缺失突變，以研究基因中不同區(qū)段的功

能。

也可以用Bal31核酸酶能識別雙鏈DNA中的未配對單鏈部分而將之切斷成為

線性分子來研究DNA的超螺旋狀態(tài)。這一點(diǎn)也類似于S1核酸酶的作用。

3.4.2雙鏈DNA內(nèi)切酶

基因重組涉及最多的還是切割和連接DN