押江蘇卷第24題 基因工程-備戰(zhàn)2023年高考生物臨考題號押題（江蘇卷）（解析版）

學(xué)而優(yōu)·教有方PAGEPAGE1押江蘇卷第24題基因工程從近幾年的新課標(biāo)卷的考查知識(shí)點(diǎn)來看，第24題主要考查基因工程知識(shí)?；蚬こ痰牧鞒毯蛻?yīng)用是高考的必考點(diǎn)，且常考常新，預(yù)計(jì)2023年高考也不例外，依然會(huì)對其進(jìn)行考查，有可能與新的科研實(shí)事結(jié)合，綜合考查基因工程的流程和應(yīng)用，比如新冠病毒疫苗的研發(fā)，還可能與細(xì)胞工程、胚胎工程等綜合起來考查。能準(zhǔn)確識(shí)記課本內(nèi)容，會(huì)正確分析圖形，并從題干中摘取關(guān)鍵信息，規(guī)范答題。能夠結(jié)合背景材料分析問題、解決問題。從題圖中提取有效信息并結(jié)合這些信息，運(yùn)用所學(xué)知識(shí)與觀點(diǎn)，通過比較、分析與綜合等方法對某些生物學(xué)問題進(jìn)行解釋、推理，做出合理的判斷或得出正確結(jié)論。把握知識(shí)間的內(nèi)在聯(lián)系，要求能運(yùn)用所學(xué)知識(shí)解決生活中的一些實(shí)際問題，或運(yùn)用所學(xué)知識(shí)解釋生活中的一些現(xiàn)象(2022江蘇卷T24).纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異?？梢鸲喾N疾病。因此，研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請回答下列問題。（1）纖毛結(jié)構(gòu)如圖1所示，由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由中心體轉(zhuǎn)變而來，中心體在有絲分裂中的功能是__________________。（2）某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來，溶液中添加NaC1至2．0mo1/L的目的是__________________。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在__________________催化下，在引物__________________端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測序。（3）為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X-GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖Ⅱ所示載體質(zhì)粒Y，構(gòu)建Y-M重組質(zhì)粒（在EcoRⅤ位點(diǎn)插入片段）。請完成下表。分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)簡易操作、結(jié)果、分析PCR鑒定正向重組質(zhì)粒Y-M（圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向）①選擇圖Ⅱ引物_____________；②PCR目的產(chǎn)物約為_____________bp。確保M及連接處序列正確，Y-M的連接處上游含有HindIII+EcoRV的識(shí)別序列，下游含有EcoRV+BamHI的識(shí)別序列③質(zhì)粒測序，圖Ⅲ中正確的是____________（選填序列編號）檢測融合蛋白定位④對照質(zhì)粒Y-GFP（僅表達(dá)GFP）與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y-M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明________________________。（4）為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)_____________形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20（Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)）。從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的_____________倍?！敬鸢浮浚?）與有絲分裂有關(guān)（參與紡錘體的形成，是紡錘體形成中心）（2）①.溶解DNA②.耐高溫DNA聚合酶（Taq酶）③.3'（3）①.a、b②.1100③.Q4④.X蛋白參與中心體的形成（4）①.逆轉(zhuǎn)錄②.32【解析】【分析】PCR技術(shù)的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈?！拘?詳解】中心體與有絲分裂有關(guān)，是紡錘體的組織中心?！拘?詳解】從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來，DNA在2．0mo1/L的NaC1溶液中的濃度最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會(huì)下降，因此實(shí)驗(yàn)過程中添加NaC1至2．0mo1/L的目的是溶解DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在耐高溫的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測序?！拘?詳解】PCR擴(kuò)增目的DNA片段時(shí)，在引物的3’端進(jìn)行DNA鏈的延伸，據(jù)圖可知，應(yīng)選擇圖II中的引物a和引物b，PCR目的產(chǎn)物約為300+800=1100bp。確保M及連接處序列正確，Y-M的連接處上游含有HindIII+EcoRV的識(shí)別序列，下游含有EcoRV+BamHI的識(shí)別序列，根據(jù)題干信息構(gòu)建Y-M重組質(zhì)粒（在EcoRⅤ位點(diǎn)插入片段），Y-M的連接處測序后部分序列應(yīng)含有EcoRV+BamHI的識(shí)別序列，根據(jù)EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，應(yīng)選擇序列Q4。對照質(zhì)粒Y-GFP（僅表達(dá)GFP）與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y-M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質(zhì)X參與中心體的組成?！拘?詳解】研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20（Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)），說明病人基因Z表達(dá)較弱，設(shè)健康人Z基因的cDNA數(shù)為x，病人Z基因的cDNA數(shù)為y，則有x×215=y×220，從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的25=32倍。(2021江蘇卷T23).某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒，請結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問題：（1）目的基因的擴(kuò)增①提取真菌細(xì)胞______，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)一步獲得基因m片段。②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計(jì)引物P2時(shí)，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致______。③熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是：先將除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增，下列敘述正確的有______A．Taq酶最適催化溫度范圍50～60℃B．與常規(guī)PCR相比，熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸D．PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了Taq酶的特異性（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建①將SmaI切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)______，形成A-m結(jié)合體。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—m仍能被SmaI切開，則SmaI的酶切位點(diǎn)可能在______。（3）融合蛋白的表達(dá)①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A-m，然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是______。②若通過抗原一抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說明______，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。【答案】（1）①.mRNA②.蛋白M上不含tag標(biāo)簽③.BC（2）①.黏性末端堿基配對②.DNA連接③.基因m的連接處、基因m的內(nèi)部（3）①.受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落②.融合基因表達(dá)（或融合基因正確解碼）【解析】【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。【小問1詳解】①以逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細(xì)胞中提取基因m轉(zhuǎn)錄出來的mRNA。②從構(gòu)建好的重組質(zhì)粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動(dòng)到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會(huì)對tag序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行翻譯，蛋白M上就不含tag標(biāo)簽。③A、從題干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增”，故Taq酶最適催化溫度范圍為94℃左右，A錯(cuò)誤；B、PCR反應(yīng)的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結(jié)合，并在TaqDNA聚合酶的作用下延伸，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物的擴(kuò)增，影響反應(yīng)的特異性；熱啟動(dòng)可減少引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物的擴(kuò)增，提高反應(yīng)的特異性，B正確；C、DNA分子復(fù)制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；D、Taq酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫，D錯(cuò)誤。故選BC?！拘?詳解】①從圖上看，載體A只有一個(gè)SmaI的酶切位點(diǎn)，故被SmaI切開后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA，將SmaI切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補(bǔ)配對。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②重組質(zhì)粒中，載體A被SmaI切開的位置已經(jīng)與基因m相連，原來的酶切位點(diǎn)已不存在，若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—m仍能被SmaI切開，則SmaI的酶切位點(diǎn)可能在基因m的連接處或基因m內(nèi)部?！拘?詳解】①篩選目的菌株的機(jī)理是：導(dǎo)入了質(zhì)粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過抗原一抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測到酵母蛋白中含lag標(biāo)簽，位于lag標(biāo)簽上游的基因m應(yīng)該正常表達(dá)，說明融合基因表達(dá)（或融合基因正確解碼）?！军c(diǎn)睛】本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)，能將教材中的知識(shí)結(jié)合題中信息進(jìn)行知識(shí)遷移，準(zhǔn)確答題。1．血凝素基因（H）編碼的血凝素是構(gòu)成流感病毒囊膜纖突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2兩個(gè)亞單位，其中HA1含有病毒與受體相互作用的位點(diǎn)。lgGFc基因片段（長度為717bp）編碼人lgG抗體中的一段小肽，常作為融合蛋白標(biāo)簽。蛋白質(zhì)分泌依賴于信號肽的引導(dǎo)，本研究中用信號肽IL-2SS代替HA自身信號肽，科研人員嘗試構(gòu)建IL-2SS/HA/lgGFc融合蛋白表達(dá)載體，并導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)和分泌，請回答：(1)流感病毒囊膜主要由______組成，囊膜上血凝素的合成場所在______。(2)本實(shí)驗(yàn)用信號肽IL-2SS代替HA自身信號肽有利于______，PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)應(yīng)該選擇圖中引物____設(shè)計(jì)引物時(shí)，不能包含基因HA的終止密碼子的編碼序列，原因是____。(3)應(yīng)選擇限制酶____來切割質(zhì)粒A，然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合，同時(shí)加入____酶，使得目的基因與質(zhì)粒A相連。(4)若目的基因與質(zhì)粒A正向連接，HA1基因轉(zhuǎn)錄時(shí)的模板鏈?zhǔn)怯蓤D中的引物______（填“a”、“b”、“c”或“d”）在PCR時(shí)延伸而成；若目的基因與質(zhì)粒A反向連接，用BamHI和SacI同時(shí)切割重組質(zhì)粒，完全酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，其中最靠近加樣孔的條帶長度約為________bp。(5)融合蛋白中的標(biāo)簽蛋白有利于目的蛋白的分離和純化，基因工程生產(chǎn)HA作為疫苗時(shí)，選擇人IgGFc作為標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)還有________?！敬鸢浮?1)磷脂和蛋白質(zhì)宿主細(xì)胞的核糖體(2)融合蛋白分泌到大腸桿菌細(xì)胞外b和引物c防止產(chǎn)生的HA上不含IgGFc標(biāo)簽(3)EcoRVT4DNA連接(4)c5181(5)降低免疫排斥反應(yīng)【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！驹斀狻浚?）流感病毒囊膜屬于膜結(jié)構(gòu)，主要成分是蛋白質(zhì)（血凝素）和磷脂組成，血凝素的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其合成場所是宿主細(xì)胞的核糖體（或宿主細(xì)胞的核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。（2）IgGFc基因片段（長度為717bp）編碼人IgG抗體中的一段小肽，常作為融合蛋白標(biāo)簽，HA1含有病毒與受體相互作用的位點(diǎn)，科研人員嘗試構(gòu)建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表達(dá)載體，并導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)和分泌，說明用信號肽IL-2SS代替HA自身信號肽有利于有利于融合蛋白分泌到大腸桿菌細(xì)胞外。由圖可知，引物bc可與HA1兩端的堿基序列結(jié)合，故PCR擴(kuò)增目的基因是應(yīng)選擇圖中引物b和引物c。若設(shè)計(jì)引物是含有HA1的終止密碼子，則核糖體讀到終止密碼子時(shí)就停止翻譯，導(dǎo)致IgGFc基因不能正常表達(dá)，產(chǎn)生的HA1上不含IgGFc標(biāo)簽。（3）由圖可知，限制酶EcoRV切割可產(chǎn)生平末端，其識(shí)別切割位點(diǎn)恰巧處于IL-2SS和IgGFc中間，可選擇該酶對質(zhì)粒進(jìn)行切割，然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合，同時(shí)加入T4DNA連接酶（將DNA片段連接起來），使得目的基因與質(zhì)粒A相連。（4）HA2基因的編碼序列是由圖中的引物c在PCR時(shí)延伸而成，若目的基因與質(zhì)粒A正向連接，HA1基因轉(zhuǎn)錄時(shí)的模板鏈?zhǔn)怯蓤D中的引物c在PCR時(shí)延伸而成。若目的基因與質(zhì)粒A反向連接，HA1基因片段長度為1038-51=987bp，重組質(zhì)粒長度為5554+1038-51=6541bp，IgGFc基因片段長度為717bp，二者反向相連時(shí)BamHI作用于HA1中，SacI酶作用于IgGFc末端，完全酶切后的產(chǎn)物的長度約為717+（987-344）=1360，6541-1360=5181，其中最靠近加樣孔的條帶長度約為5181bp。（5）基因工程生產(chǎn)HA1作為疫苗時(shí)，選擇人IgGFc優(yōu)點(diǎn)在于降低免疫排斥反應(yīng)。2．Cre/loxP酶系統(tǒng)是在基因或染色體水平上對生物基因進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)，可以在DNA的特定位點(diǎn)上執(zhí)行堿基序列的刪除、插入以及重組等，從而實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯。(1)圖1是利用Cre/loxP酶系統(tǒng)敲除基因的過程。loxP序列具有方向性，由中間的間隔序列和兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成。當(dāng)某一條DNA片段上待敲除基因的兩端存在同向loxP序列時(shí)，Cre酶識(shí)別并結(jié)合到loxP序列的反向重復(fù)序列區(qū)。兩個(gè)loxP序列的間隔序列被Cre酶定點(diǎn)切開，4個(gè)黏性末端序列交錯(cuò)兩兩連接，其中待敲除基因兩端的序列進(jìn)行連接，連接時(shí)形成的化學(xué)鍵是___________，敲除的基因片段會(huì)形成___________（填“線狀”或“環(huán)狀”）結(jié)構(gòu)。(2)圖2是利用Cre/loxP酶系統(tǒng)構(gòu)建融合基因的過程。首先要用PCR對Bt基因和Bar基因分別擴(kuò)增，以獲得所需要的DNA片段，然后對連接后的DNA片段用Cre/loxP酶系統(tǒng)處理獲得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1擴(kuò)增Bt基因時(shí)，所用的2種引物的結(jié)合位置在____________；又有研究表明，大多數(shù)限制酶對裸露的位點(diǎn)不能識(shí)別切割，因此必須對識(shí)別序列5'末端進(jìn)行修飾并加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，如GGG。由此推測，對Bar基因引物5’端序列的要求是___________。(3)圖3是用Cre/loxP酶系統(tǒng)敲除轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)Bar基因的部分過程。已知圖中的啟動(dòng)子和終止子可在煙草細(xì)胞中正常發(fā)揮作用，Cre酶基因在環(huán)境中存在Tam化學(xué)物質(zhì)時(shí)才能激活表達(dá)。重組Ti質(zhì)粒中的Bar基因作為基因表達(dá)載體中的___________可對轉(zhuǎn)化后的煙草細(xì)胞進(jìn)行篩選。進(jìn)行圖3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正確表達(dá)，據(jù)圖分析，原因是___________；若不對融合基因中的Bar基因進(jìn)行敲除處理，僅在翻譯水平上不讓Bar基因表達(dá)，請利用Cre/loxP酶系統(tǒng)提出解決方案___________。(4)圖4是經(jīng)過修飾后的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)的融合基因所在片段及相關(guān)引物的結(jié)合位點(diǎn)。為檢測Bar基因是否被成功敲除同時(shí)未影響B(tài)t基因的正常表達(dá)，可用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定：實(shí)驗(yàn)組：首先提取在有Tam環(huán)境下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞質(zhì)中的總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后加入引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無Bt基因和Bar基因的條帶。對照組：用未進(jìn)行敲除處理的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞，其余同實(shí)驗(yàn)組。若實(shí)驗(yàn)組敲除成功，則實(shí)驗(yàn)組和對照組的電泳結(jié)果分別為___________?！敬鸢浮?1)磷酸二酯鍵環(huán)狀(2)Bt的兩種引物分別在啟動(dòng)子外側(cè)和終止子內(nèi)側(cè)（啟動(dòng)子和終止子的左側(cè)）引物的5'端均要連接上loxP序列，并在末端加上保護(hù)堿基序列（GGG）(3)標(biāo)記基因缺少Bar的終止子利用Cre/loxP酶系統(tǒng)在Bt基因和Bar基因之間插入終止密碼子對應(yīng)的DNA序列(4)實(shí)驗(yàn)組兩種基因的條帶都無，對照組兩種基因的條帶都有【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！驹斀狻浚?）基因中一條鏈上脫氧核苷酸之間是通過磷酸二酯鍵連接，因此待敲除基因兩端的序列進(jìn)行連接時(shí)，形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。據(jù)圖可知，當(dāng)某一條DNA片段上待敲除基因的兩端存在同向loxP序列時(shí)，Cre酶識(shí)別并結(jié)合到loxP序列的反向重復(fù)序列區(qū)，這樣敲除的基因片段的兩端因?yàn)槭怯猛N酶進(jìn)行切割，產(chǎn)生的是互補(bǔ)的黏性末端，他們會(huì)通過堿基互補(bǔ)配對原則形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（2）啟動(dòng)子是決定RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的DNA序列，終止子是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列，啟動(dòng)子一般在目的基因的左側(cè)（外側(cè)），終止子在目的基因的右側(cè)（內(nèi)側(cè)），因?yàn)橐@得Bt-Bar融合基因片段，即需要Bt帶上啟動(dòng)子（不需要終止子）、Bar帶上終止子（不需要啟動(dòng)子），因此在用PCR1擴(kuò)增Bt基因時(shí)，所用的2種引物的結(jié)合位置在Bt的兩種引物分別在啟動(dòng)子外側(cè)和終止子內(nèi)側(cè)。據(jù)圖2可知，Bt-Bar融合基因片段中Bar基因的左側(cè)和右側(cè)都含有l(wèi)oxP序列，又因?yàn)榇蠖鄶?shù)限制酶對裸露的位點(diǎn)不能識(shí)別切割，因此必須對識(shí)別序列5'末端進(jìn)行修飾并加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，如GGG，據(jù)此可知，對Bar基因引物5’端序列的要求是引物的5'端均要連接上loxP序列，并在末端加上保護(hù)堿基序列（GGG）。（3）圖3是用Cre/loxP酶系統(tǒng)敲除轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)Bar基因的部分過程，基因表達(dá)載體主要由啟動(dòng)子、目的基因、標(biāo)記基因和終止子組成，因此推測Bt基因是目的基因，Bar基因是標(biāo)記基因，可對轉(zhuǎn)化后的煙草細(xì)胞進(jìn)行篩選。Bt-Bar融合基因片段中的啟動(dòng)子是Bar基因的，終止子是Bar基因的，圖中DNA片段1中不存在Bar基因及其終止子，因此DNA片段1中的Bt基因不能正確表達(dá)。若不對融合基因中的Bar基因進(jìn)行敲除處理，僅在翻譯水平上不讓Bar基因表達(dá)，在Bt基因后面插入能翻譯終止的mRNA序列，這樣Bar基因就會(huì)因?yàn)闆]有啟動(dòng)子不能轉(zhuǎn)錄，因此利用Cre/loxP酶系統(tǒng)提出解決方案為：利用Cre/loxP酶系統(tǒng)在Bt基因和Bar基因之間插入終止密碼子對應(yīng)的DNA序列。（4）PCR時(shí)，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的，如果Bar基因被成功敲除同時(shí)未影響B(tài)t基因的正常表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中引物1不能結(jié)合到要擴(kuò)增的目的基因上，不能進(jìn)行擴(kuò)增，因此兩種基因的條帶都無，對照組因此基因沒有敲除，因此兩個(gè)基因都能正常擴(kuò)增，因此兩種基因的條帶都有。3．新冠病毒（＋RNA）的刺突蛋白S通過與人體黏膜細(xì)胞表面的ACE2受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，是宿主抗體的重要作用位點(diǎn)。下圖1是科研人員利用新冠病毒的＋RNA提取S蛋白基因和S蛋白受體結(jié)合域RBD基因作為抗原基因序列，研制新冠病毒雙抗原疫苗的技術(shù)路線。已知PCR1與PCR2要分別進(jìn)行，然后將產(chǎn)物混合，使用引物1和引物4進(jìn)行PCR3，最終獲得大量S－RBD融合基因（1500bp）。(1)PCR3過程中，片段1與片段2連接形成S－RBD融合基因，需要使用______酶。為使S－RBD融合基因能與pX質(zhì)粒相連接，并在工程菌中表達(dá)時(shí)先合成S蛋白，則PCR1過程中，應(yīng)在引物1的5'端添加的限制酶序列是______。(2)為初步檢測過程B構(gòu)建是否成功，用EcoRⅠ、NdeⅠ、HindⅢ對重組pX系列質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切，然后對重組pX系列質(zhì)粒及其酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2，據(jù)圖可知，重組質(zhì)粒pX2和pX5構(gòu)建成功的依據(jù)是______。(3)在工程菌的篩選時(shí)，可先后用兩種抗生素進(jìn)行影印培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（即使用無菌的絨氈布壓在培養(yǎng)基A的菌落上，帶出少許菌種，平移并壓在培養(yǎng)基B上），在培養(yǎng)基B中存活的菌落是否含有目的基因_______（填“是”或“否”）。鑒定重組pX質(zhì)粒是否導(dǎo)入工程菌還可以采用的方法是_______。(4)試從免疫學(xué)角度分析此種雙抗原疫苗比常規(guī)S蛋白疫苗更具優(yōu)勢的原因_______。【答案】(1)耐高溫的DNA聚合（TaqDNA聚合酶）5'CATATG3'(2)重組質(zhì)粒pX2和pX5酶切后形成的1000bp和500bp片段堿基對總和等于S－RBD融合基因長度1500bp(3)否觀察菌落是否具有熒光(4)此種雙抗原疫苗含有S蛋白受體結(jié)合域RBD，有利于進(jìn)入靶細(xì)胞．從而激發(fā)細(xì)胞免疫【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測與鑒定?！驹斀狻浚?）由于操作過程具有較高的溫度，故PCR過程中，需要的酶是耐高溫DNA聚合酶；該酶的作用是將單個(gè)的脫氧核苷酸連接到引物的3'端。據(jù)圖可知，目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子和終止子之間，可選擇的酶有HindⅢ、Ndel，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，用于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，原核細(xì)胞中基因表達(dá)時(shí)可以邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯，引物4對應(yīng)的區(qū)段靠近啟動(dòng)子時(shí)先轉(zhuǎn)錄出S蛋白的mRNA序列，故引物4對應(yīng)的區(qū)段要連接在靠近啟動(dòng)子部位，引物1對應(yīng)的區(qū)段要連接在靠近終止子部位。引物1的5'端添加的限制酶序列應(yīng)與NdeI限制酶切割的黏性末端的序列能堿基互補(bǔ)，所以引物1的5'端添加的限制酶序列是5'CATATG3'。（2）使用引物1和引物4進(jìn)行PCR3，最終獲得大量S－RBD融合基因（1500bp）,用EcoRⅠ、NdeⅠ、HindⅢ對重組pX系列質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切，然后對重組pX系列質(zhì)粒及其酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測；重組質(zhì)粒pX2和pX5構(gòu)建成功的依據(jù)是重組質(zhì)粒pX2和pX5酶切后形成的1000bp和500bp片段堿基對總和等于S－RBD融合基因長度1500bp。（3）在工程菌的篩選時(shí)，由于含目的基因的菌落對第二次培養(yǎng)時(shí)使用的抗生素?zé)o抗性，故在第二次培養(yǎng)時(shí)存活的菌落不含目的基因；鑒定pX質(zhì)粒是否導(dǎo)入工程菌還可以采用的方法是：觀察菌落是否具有熒光，有熒光的則含有pX質(zhì)粒。（4）分析題意可知，此種雙抗原疫苗含有S蛋白受體結(jié)合域RBD，有利于進(jìn)入靶細(xì)胞，從而激發(fā)細(xì)胞免疫，故此種雙抗原疫苗比常規(guī)S蛋白疫苗更具優(yōu)勢。4．重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的技術(shù)，可通過定點(diǎn)誘變在體外改造DNA分子，并將改造后的目的基因?qū)胭|(zhì)粒構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。(1)上圖所示的重疊延伸PCR技術(shù)中，PCR1的引物是_________。PCR4可獲得大量定點(diǎn)誘變目的基因，此時(shí)的引物為__________。PCR3時(shí)模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是___________。(2)為使重疊延伸PCR技術(shù)改造后的目的基因（該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列）能與載體正確連接，PCR4時(shí)，應(yīng)在基因上、下游引物的_________端分別添加限制酶_________的酶切位點(diǎn)。(3)將目的基因、質(zhì)粒及大腸桿菌混合，溫育一段時(shí)間后涂在含四環(huán)素的平板上培養(yǎng)，一段時(shí)間后平板上長出菌落。這些菌落的菌體內(nèi)_________（填“一定不一定”）含有目的基因，理由是_________?！敬鸢浮?1)引物A、引物C引物C、引物D子鏈的延伸方向只能從5’→3'，以DNA分子③作模板時(shí)子鏈不能延伸(2)5Kpnl、EcoRl(3)不一定含有空白質(zhì)粒的大腸桿菌也能在該培養(yǎng)上生長【分析】PCR原理：在DNA復(fù)制中，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以四種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物的作用下，DNA聚合酶從引物3’端開始延伸DNA鏈?！驹斀狻浚?）由于DNA合成的方向是從子鏈的5’端到3’端延伸的，根據(jù)PCR1的產(chǎn)物，可知引物是引物A、引物C。根據(jù)PCR2的產(chǎn)物，PCR2的引物為引物B、引物C，將DNA分子②④混合后退火可得到③⑤，PCR3獲得DNA⑥，DNA⑥分子的3’端與引物D互補(bǔ)配對，5’端與引物C互補(bǔ)配對，所以PCR4的引物為引物C、引物D；PCR3為了獲得重疊鏈，模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是子鏈的延伸方向只能從5’→3'，以DNA分子③作模板時(shí)子鏈不能延伸。（2）為使重疊延伸PCR技術(shù)改造后的目的基因能與載體正確連接，PCR4時(shí)，應(yīng)在基因上、下游引物的5'端分別添加限制酶，因?yàn)樽渔湹难由焓菑?'端開始的。目的基因應(yīng)插在啟動(dòng)子和終止子之間，由于pstI靠近終止子，所以應(yīng)在基因上、下游引物的5'端分別添加限制酶Kpnl、EcoRl。（3）目的基因、質(zhì)粒及大腸桿菌混合，可能有一些質(zhì)粒與目的基因成功連接，可能也有些質(zhì)粒沒有與目的基因連接，這些質(zhì)粒若成功導(dǎo)入大腸桿菌，由于質(zhì)粒上有四環(huán)素抗性基因，所以都能在含四環(huán)素的的平板上長出菌落，所以這些菌落不一定含有目的基因。5．為探究Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白3（BAG3）在細(xì)胞自噬中的作用，科研人員計(jì)劃從質(zhì)粒A中獲取BAG3基因，將其接入質(zhì)粒pGEX-4T1，然后在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)蛋白，用于后續(xù)研究。請回答下列問題：(1)BAG3的基因序列如下圖所示：由于BAC3基因兩側(cè)沒有合適的酶切位點(diǎn)，并確定內(nèi)部不含有EcoRI、XhoI限制酶的識(shí)別序列。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需將引物與限制酶的識(shí)別序列相連，以便將目的基因與載體相連。設(shè)計(jì)出的引物是（

）A．引物5'-TTGAATTCATGAGCGCCGCCACCCACTC-3'B．引物5'-TTGAATTCTACTCGCGGCGGTGGGTGAG-3'C．引物5'-TAGAGCTCCGGTGCTGCTGGGTTACCAC-3'D．引物5'-TACTCGAGCGGTGCTGCTGGGTTACCAG-3'(2)合成引物后，以_____為模板進(jìn)