DB21T 2280-2014 水產(chǎn)養(yǎng)殖用扁藻培養(yǎng)操作技術(shù)規(guī)程　

ICS65.150B51DB21DB21/T2280—2014水產(chǎn)養(yǎng)殖用扁藻培養(yǎng)操作技術(shù)規(guī)程TechnicalSpecificationforculturingofTetraselmisChuiusinginaquaculture遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2280—2014本標(biāo)準(zhǔn)的附錄B為規(guī)范性附錄，附錄A和附錄C為資料性附錄本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋與漁業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張明、王笑月、林杉杉、李華琳。1DB21/T2280—2014本標(biāo)準(zhǔn)給出了水產(chǎn)養(yǎng)殖用扁藻培養(yǎng)的術(shù)語和定義。規(guī)定了扁藻培養(yǎng)的水質(zhì)條件和設(shè)施設(shè)備、消毒方法、培養(yǎng)液的配制、藻種來源、培養(yǎng)方法、日常管理、敵害生物防治等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用扁藻的培養(yǎng)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)NY5052無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)NY5071無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1單種培養(yǎng)在不排除細(xì)菌存在的條件下進(jìn)行的單一藻種培養(yǎng)的方法。3.2接種在無敵害生物和雜藻污染的條件下，把選中的藻種轉(zhuǎn)移到事先配好的培養(yǎng)基使其繁殖增長的一種操3.3封閉式培養(yǎng)將藻種在封閉透明的容器中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。容器除了充氣管、加液管和藻液抽出管外，不與外界接觸。3.4開放式培養(yǎng)將藻種在敞開的容器中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。2DB21/T2280—20143.5一次性培養(yǎng)在有限容積的培養(yǎng)容器中，加入定量培養(yǎng)液，接入藻種，藻細(xì)胞生長繁殖達(dá)到較高的密度時(shí)，不加入或不更換培養(yǎng)液，一次性全部收獲或全部用于下一級接種的培養(yǎng)方式。3.6一級培養(yǎng)、二級培養(yǎng)和三級培養(yǎng)一級培養(yǎng)（小型培養(yǎng)）：目的是保種和供應(yīng)藻種。二級培養(yǎng)（中繼培養(yǎng)）：目的是擴(kuò)種，以滿足生產(chǎn)性大量培養(yǎng)的需要。三級培養(yǎng)（生產(chǎn)性培養(yǎng)）：目的是大量培養(yǎng)以供給餌料。4水質(zhì)條件和設(shè)施設(shè)備4.1水質(zhì)條件應(yīng)符合GB11607和NY5052要求。4.2設(shè)施設(shè)備4.2.1室外海水處理設(shè)施室外海水處理主要設(shè)施包括蓄水池、沉淀池、過濾設(shè)備、抽水泵及輸水管道。4.2.2清洗消毒間用于清洗、消毒培養(yǎng)容器及消毒海水的操作空間。配有水槽、自來水、三角燒瓶、培養(yǎng)容器放置架、電爐或煤氣灶等。4.2.3藻種間進(jìn)行營養(yǎng)液配制及一級藻種培養(yǎng)的空間。要求光線充足，配有顯微鏡、藥品柜、冷藏柜、有關(guān)化學(xué)試劑和藥品、天平、三角燒瓶（容積一般為5000mL）、藻種培養(yǎng)架（或藻種搖床）、控溫設(shè)施等。4.2.4餌料培養(yǎng)間用于二級培養(yǎng)和三級培養(yǎng)的空間，要求光線充足、通風(fēng)條件好。配有化學(xué)試劑和藥品、天平、量筒、稱量操作臺、溫度計(jì)、消毒盆、耐酸堿手套及處理水池、培養(yǎng)池、輸水、控溫、調(diào)光設(shè)施，餌料培養(yǎng)間規(guī)模應(yīng)根據(jù)育苗養(yǎng)殖水體而定。二級培養(yǎng)采用50000mL～100000mL光生物反應(yīng)器或容量較大且透光較好的玻璃瓶、聚乙烯桶、塑料袋等容器。三級培養(yǎng)采用培養(yǎng)池，深度一般0.8m～1.0m，容積5m3～20m3；培養(yǎng)池應(yīng)設(shè)有排污閥，配有攪拌耙。5消毒方法5.1消毒用藥品消毒用藥品應(yīng)符合NY5071要求。3DB21/T2280—20145.2一級培養(yǎng)用海水及容器的消毒將適量海水注入三角燒瓶，然后用淡水清洗瓶口及外壁，擦干瓶底水珠，置于電爐或燃?xì)庠钌现蠓?min，再用無菌紙蓋和橡皮套封口，冷卻至室溫后使用。5.3二級培養(yǎng)用海水及容器的消毒5.3.1二級培養(yǎng)用海水的消毒采用燒瓶、搪瓷桶、專用海水消毒爐等將海水煮沸5min消毒，冷卻至室溫后使用。5.3.2二級培養(yǎng)容器的消毒培養(yǎng)容器及攪拌耙可于4﹪~8﹪的稀鹽酸（37﹪濃鹽酸稀釋5～10倍）中浸泡2h以上，倒凈酸水，用煮沸并冷卻至60℃以下的水沖洗2遍，冷卻后使用。5.4三級培養(yǎng)用海水及培養(yǎng)池的消毒5.4.1三級培養(yǎng)用海水的消毒按1m3海水加入含20mg～40mg有效氯的次氯酸鈉液消毒處理12h～24h，然后按1m3加入25g～55g硫代硫酸鈉還原，并用碘化鉀淀粉試劑（配制與余氯檢測見附錄A）或碘化鉀淀粉試紙測試，無余氯后才可使用。用于還原余氯的硫代硫酸鈉量隨次氯酸鈉有效氯的變化而定，應(yīng)適量。5.4.2三級培養(yǎng)池的消毒用含有效氯0.5﹪~1﹪的次氯酸鈉液稀釋液均勻地抹洗培養(yǎng)池池壁、池底及攪拌耙2遍，消毒2h以上，再用去除余氯的三級海水沖洗后即可使用。也可直接用未還原的三級消毒處理水（處理方法見5.4.1）浸泡消毒6h～24h。5.5其它消毒——溫度計(jì)、稱量用天平、藥匙等可采用70%～75%酒精消毒?！患?、二級培養(yǎng)時(shí)量取營養(yǎng)鹽母液用的刻度吸管可用淡水煮沸10min消毒。——操作人員日常洗手、操作臺、培養(yǎng)架等可用0.05﹪~0.1﹪的苯扎溴銨溶液消毒?！眉八芸捎梦催€原的三級消毒處理水在水泵及水管內(nèi)循環(huán)5min～10min，然后停留6h~——耐酸堿手套表面、水桶、水舀等可用4﹪~8﹪的稀鹽酸或含有效氯0.5﹪~1﹪的次氯酸鈉液稀釋液進(jìn)行消毒，但鹽酸與次氯酸鈉不可同時(shí)使用。6培養(yǎng)液的配制6.1培養(yǎng)用藥品培養(yǎng)用藥品應(yīng)符合NY5071要求。6.2一級、二級培養(yǎng)液配制6.2.1要求——所用藥品和試劑標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于化學(xué)純。4DB21/T2280—2014——配制全過程應(yīng)在潔凈操作間內(nèi)完成，保證無污染?！渲坪玫哪敢簯?yīng)遮光冷藏保存。6.2.2配制方法按附錄B扁藻培養(yǎng)液配方將營養(yǎng)鹽成分（包括檸檬酸鐵、磷酸二氫鉀、尿素、硝酸鈉）及維生素成分（包括維生素B1和維生素B12）用蒸餾水或純凈水各配成1000倍的母液，使用時(shí)按每升消毒海水添加1mL營養(yǎng)鹽母液+1mL維生素母液而配成一、二級培養(yǎng)液。6.3三級培養(yǎng)液配制6.3.1要求——所用藥品可用無污染的農(nóng)用化肥替代?！渲迫^程應(yīng)認(rèn)真消毒，保證無污染。6.3.2配制方法按附錄B扁藻培養(yǎng)液配方直接稱量營養(yǎng)鹽、維生素，投入去除余氯的三級海水中，溶解攪勻即可。7藻種來源7.1藻種引入——從海洋微藻專業(yè)保種單位引入。——貝類育苗用藻種應(yīng)在需用餌料的2～3個(gè)月前引入，其他水產(chǎn)養(yǎng)殖用藻種根據(jù)實(shí)際情況而定?！N數(shù)量按扁藻每7d成倍增加的速度，根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體大小、餌料需要量等推算確定。7.2藻種提純7.2.1提純方法在適量的藻種培養(yǎng)液中加入1%～1.5%瓊脂，加熱溶化、滅菌，無菌條件下倒平板，冷卻后用無菌接種環(huán)或接種棒將少量藻液在固體培養(yǎng)基表面劃線，按附錄C條件培養(yǎng)10d～20d，在無菌操作臺上用解剖鏡，選具有純種特征、獨(dú)立、無污染的藻落，用無菌牙簽或接種針將其挑入適量培養(yǎng)液中培養(yǎng)。7.2.2提純次數(shù)藻種每年應(yīng)至少提純1次。8培養(yǎng)方法8.1一級藻種培養(yǎng)8.1.1培養(yǎng)方式封閉式單種培養(yǎng)。8.1.2培養(yǎng)方法——按5.2方法消毒三角燒瓶和適量海水，冷卻至室溫使用。5DB21/T2280—2014——按6.2.2方法配制培養(yǎng)液。——將藻種與培養(yǎng)液按2:1～1：1比例接種?！?jīng)過5d～15d的培養(yǎng)后，藻液顏色較深、密度較大時(shí)應(yīng)及時(shí)添加新的培養(yǎng)液或及時(shí)分瓶培養(yǎng)。8.1.3要求扁藻培養(yǎng)應(yīng)在其最適生態(tài)條件(見附錄C)下培養(yǎng)；操作過程中應(yīng)認(rèn)真消毒，確保無污染。8.2二級藻種培養(yǎng)8.2.1培養(yǎng)方式開放式單種培養(yǎng)。8.2.2培養(yǎng)方法——按5.2方法消毒海水、培養(yǎng)容器及攪拌耙——按6.2.2方法配制培養(yǎng)液?！獙⒁患壴宸N與培養(yǎng)液按1:2～1:5比例接種，隔日視生長情況及時(shí)添加培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。8.2.3要求培養(yǎng)條件應(yīng)符合附錄C要求，攪拌耙為每個(gè)培養(yǎng)池專用，未經(jīng)消毒不可混用。8.3三級培養(yǎng)8.3.1培養(yǎng)方式開放式單種培養(yǎng)。8.3.2培養(yǎng)方法——按5.4方法消毒處理并還原海水、消毒三級培養(yǎng)池及攪拌耙?！?.3.2方法配制三級培養(yǎng)液?！孟具^的水泵或?qū)Ｓ幂斔艿缹⑴囵B(yǎng)液注入消毒好的三級培養(yǎng)池中(泡池消毒的可在原池直接還原并配成培養(yǎng)液使用)?！獙⒍壴宸N與培養(yǎng)液按1:5～1:20比例接種于三級培養(yǎng)池中培養(yǎng)?！臃N數(shù)日后，當(dāng)藻液顏色明顯變深（藻細(xì)胞密度≥50×104cell/mL），經(jīng)鏡檢無敵害生物污染時(shí)，應(yīng)及時(shí)添加新的培養(yǎng)液。8.3.3要求——接種時(shí)應(yīng)鏡檢二級藻種，無污染的才可用于接種?！獞?yīng)在上午進(jìn)行接種操作?！愵愑缰谐醮谓臃N時(shí)間應(yīng)比預(yù)計(jì)投餌時(shí)間提前15～20d。——結(jié)合養(yǎng)殖動(dòng)物的餌料需要情況及時(shí)接新藻種。——扁藻培養(yǎng)應(yīng)在其最適生態(tài)條件下進(jìn)行；操作過程中應(yīng)認(rèn)真消毒，確保無污染。9.1一級、二級培養(yǎng)的日常管理6DB21/T2280—20149.1.1攪拌對于無充氣設(shè)施的培養(yǎng)容器，可通過搖瓶或攪拌等方法使容器內(nèi)藻液充分混合，每日早、中、晚搖動(dòng)或攪拌各1次。9.1.2溫度調(diào)節(jié)定時(shí)檢查調(diào)節(jié)溫度，保持在最適范圍內(nèi)。9.1.3調(diào)節(jié)光照根據(jù)照度變化采用白布簾、人工光源等調(diào)節(jié)光照，使其在最適范圍內(nèi)。防止陽光直射及光照太弱，經(jīng)常將強(qiáng)光照區(qū)及弱光照區(qū)的藻種調(diào)換位置。9.1.4調(diào)節(jié)酸堿度及時(shí)對pH值偏高的藻液進(jìn)行調(diào)節(jié)，使pH值在7～8之間。9.1.5鏡檢與觀察每日觀察藻液，正常的藻液應(yīng)沉淀較少、顏色每日變深、有明顯聚集現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)異常，應(yīng)及時(shí)鏡檢，發(fā)現(xiàn)混種或被敵害生物等污染的藻液應(yīng)棄掉，并及時(shí)再接種培養(yǎng)。若無污染，按附錄C條件調(diào)整溫度、光照、pH值及營養(yǎng)，增加搖瓶或攪拌次數(shù)。9.2三級培養(yǎng)的日常管理9.2.1攪拌每日用攪拌耙攪拌培養(yǎng)池內(nèi)藻液3～4次，要求攪拌徹底又要避免藻液濺入鄰池。9.2.2溫度調(diào)節(jié)定時(shí)檢查藻液溫度，必要時(shí)可用調(diào)節(jié)室溫或直接調(diào)節(jié)藻液溫度等方法，使其保持在最適范圍內(nèi)。9.2.3調(diào)節(jié)光照在光照過強(qiáng)時(shí)用白布簾等調(diào)節(jié)，使其盡量保持在最適范圍內(nèi)。9.2.4觀察每日肉眼觀察藻液，環(huán)境適宜情況下扁藻細(xì)胞上浮于表層，對上浮不好的的藻液應(yīng)棄掉并及時(shí)接新種培養(yǎng)，補(bǔ)充空缺。9.2.5鏡檢——每日鏡檢扁藻生長繁殖情況及敵害生物污染等。如有大量敵害生物污染的，立即棄掉并及時(shí)接新種重新培養(yǎng)。——選擇擴(kuò)大培養(yǎng)藻液：新接藻種（接種后3d～7d）、鏡檢無敵害生物污染的主要用于擴(kuò)種，即繼續(xù)添加培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)?！x擇投餌藻液：三級培養(yǎng)池培養(yǎng)的新鮮藻液、細(xì)胞密度≥60×104cell/mL、鏡檢無污染的用于投餌，宜撇取上層藻液使用。老化藻液特別是超過15d的宜棄掉?！袛澈ι镌逡旱奶幚恚喝绻D料供應(yīng)緊張，可對顏色、密度正常，但鏡檢有少量敵害生物污染的三級藻液進(jìn)行處理（處理方法見10.2），殺滅敵害生物，待藻細(xì)胞恢復(fù)后再添加培養(yǎng)液培養(yǎng)。7DB21/T2280—20149.2.6記錄每日記錄鏡檢結(jié)果及接種、擴(kuò)種、投餌等情況。10敵害生物的防治10.1敵害生物的預(yù)防——培養(yǎng)過程中，對原生動(dòng)物等敵害生物應(yīng)以預(yù)防為主?！鳝h(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)格操作，認(rèn)真消毒，確保一、二級藻種無污染；確保整個(gè)三級培養(yǎng)無人為操作污染?！獙Ρ庠宓娜壗臃N應(yīng)有計(jì)劃進(jìn)行，適時(shí)新接藻種?！黾右患?、二級藻種數(shù)量及密度，加大三級接種時(shí)藻液密度?！诒ＷC餌料能正常供應(yīng)的前提下，及時(shí)將老化的藻液棄掉?！壟囵B(yǎng)應(yīng)每日鏡檢，發(fā)現(xiàn)情況，及時(shí)處理。10.2敵害生物的處理方法一般的敵害生物污染可用酸化處理法，通常傍晚進(jìn)行酸化。用鹽酸（鹽酸與淡水比例為1：1～1：10）使藻液pH值降至3～4,0.5h～2h后敵害生物可被殺死。然后用NaOH水溶液中和，使pH值恢復(fù)至7.5~8.5，一般經(jīng)過12h～18h藻細(xì)胞能恢復(fù)正常，此時(shí)可以再添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。8DB21/T2280—2014（資料性附錄）碘化鉀淀粉試劑的配制及余氯檢測方法試劑配制：稱取1g淀粉至200mL蒸餾水或純凈水中，加熱并不斷攪拌至液體澄清，冷卻后加入2g碘化鉀搖勻。此試劑應(yīng)避光低溫保存。余氯檢測：取被檢測海水10mL～50mL，滴入幾滴碘化鉀淀粉試劑，若被檢測海水不變色，則無余氯；若被檢測海水變藍(lán)色,則有余氯。9D