生物素材：教材梳理DNA重組技術(shù)的基本工具

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精庖丁巧解牛知識(shí)·巧學(xué)一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”基因工程的“分子手術(shù)刀”指的是DNA限制性核酸內(nèi)切酶（以下簡(jiǎn)稱限制酶).限制酶主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定部分的兩個(gè)核苷酸之間“切割”DNA分子。例如，從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制酶只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開(kāi)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了二百多種限制酶，它們的切點(diǎn)各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲(chóng)基因就能被某種限制酶切割下來(lái)。疑點(diǎn)突破限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列和切開(kāi)部位有何特點(diǎn)?限制酶所識(shí)別的序列,大多數(shù)是由6個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成,但都可以找到一條中軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的；任何一種限制酶因其本身性質(zhì)所決定，都只識(shí)別和切斷特定的核苷酸序列,而不是在任何部位都能將DNA切開(kāi).要點(diǎn)提示當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中軸線兩側(cè)將DNA兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端；在中軸線處切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。二、DNA連接酶—-“分子縫合針"被限制酶切開(kāi)的黏性末端，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸,它們之間正好互補(bǔ)配對(duì).可以設(shè)想,如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái),似乎就可以合成重組的DNA分子了。但是，實(shí)際上僅僅這樣做是不夠的，互補(bǔ)的堿基處雖然連接起來(lái)，但是這種連接只相當(dāng)于把斷成兩截的梯子中間的踏板連接起來(lái),兩邊扶手的斷口處還沒(méi)有連接起來(lái)。要把扶手的斷口處連接起來(lái),也就是把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來(lái),還要靠另一種極其重要的工具-—DNA連接酶。辨析比較DNA連接酶和DNA聚合酶有何異同點(diǎn)？相同點(diǎn):兩者都是催化形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成);都由蛋白質(zhì)構(gòu)成。不同點(diǎn)：(1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，也不是連接互補(bǔ)堿基之間的氫鍵.（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上（不能連接單鏈DNA）的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此，DNA連接酶不需要模板。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-—“分子運(yùn)輸車(chē)"要將一個(gè)外源基因送入受體細(xì)胞，還需要有運(yùn)輸工具，這就是運(yùn)載體。作為運(yùn)載體的物質(zhì)必須具備以下條件：能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選.目前，符合上述條件并經(jīng)常使用的運(yùn)載體有質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒等。質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，它廣泛地存在于細(xì)菌中,是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細(xì)菌染色體DNA的百分之一。質(zhì)粒能夠“友好”地“借居"在宿主細(xì)胞中.一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性的作用。但是，質(zhì)粒的復(fù)制則只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成.大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌等細(xì)菌中都有質(zhì)粒。因?yàn)橥寥擂r(nóng)桿菌很容易感染植物細(xì)胞，所以科學(xué)家培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，常常用土壤農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒作運(yùn)載體。難點(diǎn)剖析作為基因工程中的“分子運(yùn)輸車(chē)”—-載體，應(yīng)具備以下條件：(1）必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上;（2）載體必須具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；（3）必須帶有標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組后的篩選;（4）必須是安全的,不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去；（5）大小應(yīng)合適，太大則不易操作。問(wèn)題·探究問(wèn)題1如何準(zhǔn)確理解基因工程的含義？探究:(1)它是一種按照人們的意愿，定向改造生物遺傳特性的技術(shù)；（2）在DNA分子水平進(jìn)行操作；(3)是體外進(jìn)行的人為的基因重組；（4）一旦成功，便可遺傳；（5)主要技術(shù)為體外DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。問(wèn)題2基因操作過(guò)程中，只用到限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶嗎?探究:在基因操作過(guò)程中，除了以上兩種酶以外，還要用一系列其他酶類,才能完成全過(guò)程。例如，堿性磷酸酯酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等，這些酶都有各自特殊的功能，可以根據(jù)不同的需要選用。任何一種限制酶都只識(shí)別和切斷特定的核苷酸序列,這是由限制酶的性質(zhì)所決定的。DNA連接酶是將一段DNA片段3′端的羥基與另一DNA片段5′端磷酸基團(tuán)上的羥基連接起來(lái)形成酯鍵,而不是連接互補(bǔ)堿基之間的氫鍵.典題·熱題例1下列有關(guān)基因工程的敘述，不正確的是(）A.基因工程又叫做重組DNA技術(shù)B。對(duì)生物的基因進(jìn)行改造或重新組合,定向改造生物的遺傳性狀C。在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)牧業(yè)和環(huán)境保護(hù)等方面有廣泛的應(yīng)用D?？蓪?duì)任何物種進(jìn)行改造，控制生物的進(jìn)化解析：基因工程又叫重組DNA技術(shù)或基因拼接技術(shù),可以定向地改造生物的遺傳性狀,但是無(wú)法改造物種，更不可能控制生物的進(jìn)化。答案：D誤區(qū)警示基因工程可以對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。但是無(wú)法改造物種，更不可能控制生物的進(jìn)化,不能人為地夸大基因工程的作用。例2下列關(guān)于限制酶的說(shuō)法，正確的是(）A。限制酶廣泛存在于各種生物中,微生物中很少分布B。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列C。不同的限制酶切割DNA后都會(huì)形成黏性末端D。限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵解析:此題主要考查限制酶的有關(guān)知識(shí).限制酶主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的，并不是廣泛存在于各種生物中；一種限制酶能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)；DNA分子經(jīng)限制酶切割會(huì)形成黏性末端和平齊末端兩種。答案：B例3下列有關(guān)質(zhì)粒的敘述，正確的是()A.質(zhì)粒是廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種顆粒狀的細(xì)胞器B。質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子C。質(zhì)粒只有在侵入宿主細(xì)胞后才能復(fù)制D.細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程一定是在宿主細(xì)胞外獨(dú)立進(jìn)行的解析:質(zhì)粒是一個(gè)小型的環(huán)狀DNA分子,它可以進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞,存在于細(xì)胞內(nèi)，但它不是宿主細(xì)胞的細(xì)胞器。質(zhì)粒是一個(gè)重要的運(yùn)載體，通常利用質(zhì)粒與目的基因結(jié)合，形成重組質(zhì)粒，而后導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞.答案：B拓展延伸作為載體必須具備三個(gè)條件：（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制;(2)有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接;（3)具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。質(zhì)粒具備以上三個(gè)條件，且是基因工程中最常用的運(yùn)載體。例4關(guān)于質(zhì)粒和染色體的敘述，正確的是（）A。兩者有相同的化學(xué)本質(zhì)B。兩者是同一物質(zhì)的不同形態(tài)C。質(zhì)粒不存在于真核細(xì)胞中，染色體普遍存在于真核細(xì)胞中D。兩者的化學(xué)成分中均含有脫氧核糖解析：質(zhì)粒是存在于細(xì)菌、酵母菌等微生物細(xì)胞中的小型環(huán)狀DNA分子，染色體是真核生物細(xì)胞核中主要由DNA和蛋白質(zhì)組成的物質(zhì)。答案：D例5下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是（）A.基因工程經(jīng)常以抗菌素抗性基因?yàn)槟康幕駼.細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程常用的運(yùn)載體C。通常用一種限制性內(nèi)切酶處理含目的基因的DNA,用另一種處理載體DNAD.為育成抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體解