DB36T 1841-2023 土壤3種四環(huán)素類抗生素的測定高效液相色譜-三重四極桿質譜法　　

ICS13.020DB36Determinationofthreetetracyclineantibioticsinsoilbyhighperformanceliquidchromatography-triplequadrupolemassspe江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB36/T1841—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14方法原理 15試劑和材料 16儀器和設備 27樣品 28分析步驟 29結果計算與表示 310精密度和正確度 511質量保證和質量控制 512廢物處理 6附錄A（規(guī)范性）方法的檢出限和測定下限 7附錄B（資料性）五家實驗室的精密度和正確度匯總 8附錄C（資料性）質譜參考條件 10參考文獻 DB36/T1841—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由江西省生態(tài)環(huán)境廳提出并歸口。本文件主要起草單位：江西省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，江西省新余生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心。本文件主要起草人：趙佳文、喬支衛(wèi)、彭剛華、張振欣、歐陽濤、高明、劉燕紅、曾芳發(fā)、敖磊、陳美芬、彭惠琛、肖滿成、李曉燕、歐麗。1DB36/T1841—2023土壤3種四環(huán)素類抗生素的測定高校液相色譜-三重四極桿質譜法本文件規(guī)定了測定土壤中3種四環(huán)素類抗生素的測定高效液相色譜-三重四級桿質譜法原理、試劑材料、儀器設備、樣品采集和制備、分析測試和質量控制等技術內容。本文件適用土壤中金霉素、土霉素和四環(huán)素的測定，方法檢出限和測定下限詳見附錄A。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ613土壤干物質和水分的測定重量法HJ/T166土壤環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4方法原理使用乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液，經水平振蕩提取土壤樣品中四環(huán)素類抗生素，提取液經冷凍離心后通過固相萃取柱凈化，經濃縮后待測，使用高效液相色譜-三重四級桿質譜法，電離方式為ESI(+)，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行測定，采用外標法定量。5試劑和材料5.1實驗用水：電阻率≥18MΩ·cm，其余指標應符合GB/T6682中表1的一級標準。5.2鹽酸：優(yōu)級純。5.3鹽酸溶液：ρ（HCl）=0.5mol/L。準確量取4.17ml鹽酸（5.1）用實驗室去離子水定容至100ml。5.4乙腈：優(yōu)級純。5.5甲醇：優(yōu)級純。5.6甲酸：優(yōu)級純。5.70.1%甲酸水溶液：準確移取1.0mL甲酸加入1000mL水中，混勻。5.80.1%甲酸乙腈溶液：移取1.0mL甲酸加入1000mL乙腈中，混勻。5.9金霉素、土霉素、四環(huán)素：有證標準物質含量（99%以上）。5.10金霉素、土霉素、四環(huán)素標準貯備液（100mg/L稱取0.0100g金霉素、土霉素、四環(huán)素（5.9用甲醇（5.5）溶解并定容至100mL；于4℃冷藏、避光保存，或市售有證標準溶液。2DB36/T1841—20235.11金霉素、土霉素、四環(huán)素標準使用液（100μg/L）：移取100.0μL金霉素、土霉素、四環(huán)素標準貯備液（5.10），用甲醇（5.5）定容至100mL。5.12樣品提取液（Mclvaine緩沖溶液：乙腈=7:3）：稱取磷酸氫二鈉27.6g，檸檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二鈉鹽37.2g，調節(jié)pH約等于2，用水溶解后稀釋并定容至1000mL；移取Mclvaine緩沖溶液350mL，用乙腈稀釋定容至500mL。5.13固相萃取柱：規(guī)格為6mL/500mgHLB柱。5.14氮氣：純度≥99.999%。5.15石英砂。6儀器和設備6.1高效液相色譜-三重四極桿質譜儀：配有電噴霧離子化源（ESI）或其他等效離子源。6.2分析天平：精度為0.0001g。6.3濃縮裝置：氮吹濃縮儀或其他類型的等性能相當的設備。6.4固相萃取裝置：自動或手動，流速可調節(jié)。6.5色譜柱：C18高效液相色譜柱（規(guī)格2.1mm×100mm，1.7μm）或其他性能相近的色譜柱。6.6HY-2A調速多用振蕩器。6.7高速冷凍離心機。6.8移液槍：5μL、10μL、20μL、50μL、100μL。6.9冷凍干燥儀。6.10渦旋振蕩器。7樣品7.1樣品的采集和保存樣品采集參照HJ/T166的相關規(guī)定執(zhí)行，采集具有代表性的土壤樣品，立即置于棕色磨口玻璃瓶中，用錫箔紙封口于4℃條件下冷藏。7d內完成提取，提取液在30d內完成分析工作。7.2樣品的制備7.2.1土壤的凍干：將采集的樣品挑除石塊樹枝，挖出裝入培養(yǎng)皿中并用保鮮膜密封置于凍干機上凍干48h以上，凍干量一般為分析用量的3倍以上為宜。7.2.2干物質含量的測定：按照HJ613測定土壤樣品干物質含量。7.2.3土壤中抗生素提?。悍Q取2.0g冷凍干燥土壤樣品于50mL離心管中，加入樣品提取液（5.12）10mL，置于調速多用振蕩器（6.6）中振蕩45min，在4500r/min條件下冷凍離心10min后收集上清液，重復提取2次，然后加去離子水稀釋至200mL，待凈化。7.2.4凈化：依次用3mL甲醇（5.5）、3mL0.5mol/LHCl（5.3）溶液、3mL水活化HLB固相萃取小柱（5.13），以5mL/min速度將提取液或待凈化液通過固相萃取柱，然后依次用5mL5%甲醇溶液、5mL水淋洗固相萃取柱。真空泵抽干萃取柱，保持30min，最后用5mL甲醇洗脫，洗脫液在氮吹儀濃縮至小于1mL后，用1mL甲醇定容，渦旋溶解5min，過0.22μm濾膜后測定。8分析步驟3DB36/T1841—20238.1儀器參考條件8.1.1高效液相色譜儀參考條件見表1和表2。表1高效液相色譜儀分析條件表2梯度洗脫程序0156588.1.2離子源條件見表3。表3離子源條件），8.1.3多離子反應監(jiān)測方式（MRM）具體條件參見附錄C，對于不同質譜儀器，參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優(yōu)化到最佳。8.2標準曲線的建立準確移取一定體積的金霉素、土霉素、四環(huán)素標準使用液（5.11），用甲醇（5.5）稀釋，分別配置7種不同濃度的溶液，1.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L標準系列，待測。由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進樣，以標準系列溶液中目標組分的響應值為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，建立標準曲線。8.3樣品的測定取按（7.2）制備好的待測試樣，按照與繪制校準曲線相同的儀器分析條件進行測定。當待測試樣濃度超出標準曲線線性范圍時，樣品使用甲醇稀釋后再測定。8.4空白試驗使用石英砂，按照(7.2)進行樣品制備，與試樣相同的測定條件（8.1）進行空白試樣的測定。9結果計算與表示4DB36/T1841—20239.1定性分析按照附表C.1確定的母離子與子離子進行監(jiān)測，試樣中目標組分的保留時間與標準樣品中該組分的保留時間的相對偏差的絕對值應小于2.5%；且對待測樣品中各組分定性離子的相對豐度（Ksam，見式1）與濃度接近的標準溶液中對應的定性子離子相對豐度（Kstd，見式2）進行比較，所得偏差標準在表4規(guī)定的最大允許偏差范圍內，則可判定為樣品中存在對應的待測物。四環(huán)素的總離子色譜圖見圖1。……式中：ksam----樣品中某組分定性子離子的相對豐度，%；A2----樣品中某組分二級質譜定性子離子的峰面積；A1----樣品中某組分二級質譜定量子離子的峰面積?！街校簁sna----標準樣品中某組分定性子離子的相對豐度，%；Astaz----標準樣品中某組分二級質譜定性子離子的峰面積；Asrar----標準樣品中某組分二級質譜定量子離子的峰面積。表4定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差Kstd%Kstd>5020<Kstd≤50Kstd≤10圖1金霉素、土霉素、四環(huán)素總離子流色譜圖9.2定量分析9.2.1土壤樣品的計算結果土壤樣品中的目標物含量，按照公式（3）計算：5DB36/T1841—2023……式中：w——樣品中目標化合物含量，μg/kg；p——由標準曲線計算所得試樣中目標化合物質量濃度，μg/L；V試樣定容體積，ml；f——稀釋倍數；m——樣品稱樣量，g；wam——樣品干物質含量，%。9.3結果表示當測定結果大于等于1μg/kg時，數據保留三位有效數字；當結果小于1μg/kg時，保留至小數點后兩位。10精密度和正確度10.1精密度用5.00μg/kg；50.0μg/kg；200μg/kg低、中、高三個含量金霉素、土霉素、四環(huán)素對三個空白樣品四環(huán)素：6.6%，3.2%，3.3%。精密度數據匯總表見附錄B中表B.1。10.2正確度五家實驗室分別對空白樣品加標，加標濃度為5.00μg/kg、50.0μg/kg、200μg/kg進行分析測定。加標回收率范圍分別為：金霉素：86.6%～118%，82.0%～112%，80.5%～103%；土霉素:92.8%~100%，87.9%～113%，93.8%～102%；四環(huán)素95.4%～116%，86.9%～111%，79.6%~118%。正確度數據匯總表見附錄B中表B.2。11質量保證和質量控制11.1空白分析每次分析至少做一個空白試驗，空白試驗中檢出目標化合物的濃度不得超過方法的檢出限。11.2校準11.2.1每批樣品應繪制標準曲線，相關系數r≥0.995，否則重新繪制標準曲線。11.2.2每20個樣品或每批次樣品（少于20個樣品）應測定一個標準曲線中間濃度點標準溶液，其測定結果與該點濃度的相對偏差應≤25%，否則，需重新繪制標準曲線。11.3平行樣的測定每20個樣品或每批次（少于20個樣品）需做1個平行雙樣，平行雙樣測定結果的相對偏差應≤20%。11.4樣品加標回收率測定6DB36/T1841—2023每20個樣品或每批次（少于20個樣品）需做1個基體加標樣，加標樣與原樣品在完全相同的測試條件下進行分析。加標回收率應在70%～120%之間。12廢物處理實驗過程中產生的廢液和廢物應分類收集和保管，委托有資質的單位進行處理。7DB36/T1841—2023（規(guī)范性）方法的檢出限和測定下限表A.1方法檢出限和測定下限（單位：μg/kg）1238DB36/T1841—2023（資料性）五家實驗室的精密度和正確度匯總表B.1方法精密度匯總表2.8～9.62.2～5.12.3～8.24.4～262.4～122.6～5.44.0～272.0～102.1～5.89DB36/T1841—2023表B.2方法正確度匯總表993938939575DB36/T1841—2023質譜參考條件表B.3目標化合物的多離子反應監(jiān)測條件DB36/T1841—2023參考文獻[1]左艷麗．毛細管電泳法應用于頭孢菌素類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素藥物的檢測［D］．石家莊:河北大學,2012.[2]SPElTINIA,STURINIM,MARASCHIF,etal．Microwave-assistedex-tractionanddeterminationofenrofloxacinanddanofloxacinphoto-trans-formationproductsinsoil[J]．Analyticalandbioanalyticalchemistry,2012,404(5)．1565－1569.[3]劉瀟雅,徐源洲,賀南南,等．土壤磺胺類抗生素固相萃?。咝б合嗌V法的構建與優(yōu)化[J]．土壤,2019,51(6):1129－1136.[4]SAlVIAMV,FIEUM,VUllIETE．Determinationoftetracyclineandflu-oroquinoloneantibioticsattracelevelsinsludgeandsoil[J]．Appliedandenvironmentalsoilscience,2015,2015(11)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