非洲豬瘟病毒一體化分子檢測方法征求意見稿

1非洲豬瘟病毒一體化分子檢測方法GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范MAOPA（MagneticbeadsmediatedAll-in-OnePolymeraseAmplification）技術(shù)，即磁珠介導(dǎo)的一體逐級發(fā)生的損耗，具備較強(qiáng)的兼容性，可為各Unigen系統(tǒng)是基于MAOPA技術(shù)開發(fā)的智能軟件、搭配精密硬件的全封閉智能分析系統(tǒng)，采用微流4符號和縮略語PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）2珠全部進(jìn)入反應(yīng)體系，實現(xiàn)基于MAOPA技術(shù)的一體化分子檢測。洗脫和反應(yīng)，最后從外部對反應(yīng)液中基因擴(kuò)增引起的熒光信號變化進(jìn)行光學(xué)檢測。與傳統(tǒng)的熒光PCR險，為非洲豬瘟病毒的感染早期的精準(zhǔn)檢測及環(huán)境監(jiān)測提供了技術(shù)支6.1.6針對非洲豬瘟病毒P72基因序列設(shè)計的特異性引物和探針，并根據(jù)隨機(jī)ASFV檢測上游引物ASFV檢測下游引物ASFV檢測探針6.1.7非洲豬瘟病毒陽性對照樣品：培養(yǎng)的滅活病毒，由指定單位提供；或為含有P76.1.9內(nèi)標(biāo)樣品：含有人工內(nèi)標(biāo)基因的重組大腸桿36.1.11無菌去離子水，符合GB7.2Unigen?全封閉智能分析系統(tǒng)樣品采集及運(yùn)輸?shù)纳锇踩胧┌础禢Y/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定執(zhí)行；樣品處理的生物安全措施按《GB19489實驗室生物安全通用要求》的規(guī)定執(zhí)行；基因檢測實8.3.2拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）樣品：5000r/min離心2min，8.3.3組織研磨液樣品：5000r/min8.3.5血清或血漿樣品：無需處理，可直接吸取待4采集或處理好的樣品在2℃~8℃保存應(yīng)不超過24小時；若需長期保存，須放置?70℃以下保存，并9操作步驟9.1擴(kuò)增反應(yīng)液的配制將40μmol/LASFV檢測上游和9.2檢測卡盒的裝填裂解液依次灌裝至一體化空卡盒對應(yīng)位置，完成檢測卡盒的裝填，如附錄A.5中圖1所9.3一體化分子檢測9.3.1加樣9.3.2測定打開Unigen?全封閉智能分析系統(tǒng)翻蓋，按提示將檢測卡盒插入儀器相應(yīng)的檢測通道，按緊。提取伸58°C30秒，共45個擴(kuò)增循環(huán)，陽性對照顯示檢測結(jié)果為陽性，同時FAM通道Ct值≤30并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且內(nèi)標(biāo)ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；陰性對照顯示檢測結(jié)果為陰性，同時FAM通道無Ct值且無典型的擴(kuò)增曲線，且內(nèi)標(biāo)ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判為試待檢樣品FAM通道Ct值＜36并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)待檢樣品FAM通道無Ct值且無典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的5待檢樣品FAM通道36≤Ct值≤45并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為疑似；對疑似樣品按原條件進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果FAM通道Ct值≤45并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判為陽性；否則判為6A.1洗滌液Ⅰ稱取15.138g三羥甲基氨基甲烷、100g聚乙二醇，加滅菌純化水定容至1L，混合均勻，0.22μm濾膜A.2洗滌液Ⅱ稱取486.59g異硫氰酸胍、26.8g無水乙A.4磁珠用商品化HEPES緩沖液（1mol/L）將商品化磁珠進(jìn)行10倍A.5檢測卡盒裝填7