分子生物學(xué)基因工程操作技術(shù)

分子生物學(xué)基因工程操作技術(shù)2024/12/61第6章：基因工程操作技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細胞天然細胞生物活性物質(zhì)3基本概念基因工程（geneticengineering）

特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)

指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)基因操作（genemanipulating）2024/12/64

指把一個生物體中的基因通過無性繁殖轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆

克?。╟lone）基因克?。╣enecloning）

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體5基因重組（generecombination）

是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個新的DNA分子的過程自然界不同生物之間的基因重組是經(jīng)常發(fā)生的2024/12/661、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用表達載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。7基因操作技術(shù)的基本原理和步驟化學(xué)合成酶切片段RT-PCR文庫篩選目的基因載體原核、真核克隆、表達重組DNA載體原核細胞真核細胞表達生物活性蛋白構(gòu)建基因文庫序列分析體外基因突變瞬時表達定位、功能穩(wěn)定表達細胞系遺傳修飾動物表達產(chǎn)物功能研究生產(chǎn)活性蛋白轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染

連接8

R.oryzaegenomeDNAPCR

RoAmygenefragmentEcoRI例：米根霉a-淀粉酶基因的獲取9例：RoAmy在大腸桿菌中的表達BL21（DE3）1X2RoAmy1(0.7U/mL)RoAmy2(0.2U/mL)RoAmyX(0U/mL)破碎液IPTG誘導(dǎo)BL21（DE3condonplus）破碎液IPTG誘導(dǎo)RoAmy1(1.3U/mL)RoAmy2(0.5U/mL)RoAmyX(0U/mL)6.1目的基因的獲取供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因116.1.1目的基因的獲取方法1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成12什么是基因文庫？什么是基因組文庫？什么是部分基因文庫？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？6.1.2基因文庫概念：基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.思考：基因文庫如何構(gòu)建？

如果用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫。這種方法稱——反轉(zhuǎn)錄法cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）

DNA聚合酶雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。6.2基因表達載體的構(gòu)建過程PgpdA/EcoRIHygro/NotITtrpC/BamHIRoAmy/NheIEcoRI基因表達載體的組成它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是RNA聚合酶結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞6.3基因工程常用的工具酶酶的種類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5'磷酸基和3'羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶I①合成雙鏈cDNA的第二條鍵②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補3'末端反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA第一鏈多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5'羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶

在3'羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基堿性磷酸酶2024/12/623

識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，與相伴的甲基化酶共同構(gòu)成細菌防御機制——限制修飾體系（限制外源DNA，保護自身DNA）

HindⅢ流感噬血桿菌種屬d株第三種內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名、種名、株名限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）---剪24切割DNA后有粘端與平端之分或產(chǎn)生匹配末端識別位點常為回文結(jié)構(gòu)

AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸內(nèi)切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）2024/12/625DNA連接酶也稱DNA黏合酶，在分子生物學(xué)中扮演一個既特殊又關(guān)鍵的角色，那就是把兩條DNA黏合成一條。無論是雙股或是單股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸雙脂鍵將DNA在3'端的尾端與5'端的前端連在一起。DNA連接酶（DNAligase）---縫262728

對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應(yīng)形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。大腸桿菌DNA連接酶29T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5′磷酸基和3′羥基之間形成磷酸二酯鍵?？山与p鏈DNA的平末端、相容粘末端及其中的單鏈切口。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4Cl可以提高大腸桿菌DNA連接酶的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。T4DNA連接酶306.4基因的獲取和克隆（一）目的基因的獲得1.用PCR技術(shù)獲取基因2.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）獲得基因3.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因4．人工合成基因2024/12/6316.4.1PCR技術(shù)321、PCR原理之DNA體內(nèi)復(fù)制原理DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子2、PCR原理之DNA物理性質(zhì)3、PCR原理之體外擴增條件物理條件：1、變性（Denaturation）2、退火（Annealing）3、延生（Extention）化學(xué)條件：1、模板（Templates）2、引物（Primers）3、dNTPs4、DNA聚合酶PCR儀1DNA轉(zhuǎn)移過程中的幾個概念2、PCR原理之DNA物理性質(zhì)基因克?。╣enecloning）與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。在3'羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾缺點：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。pBV220、pET等,多種載體有商品化供應(yīng)可接雙鏈DNA的平末端、相容粘末端及其中的單鏈切口。2、引物（Primers）RoAmy/NheI基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。例：米根霉a-淀粉酶基因的獲取建立cDNA文庫的一般程序4、RT-PCR（Reversetranscript）以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。1.cDNAmRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物2.cDNAlibrary利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。cDNA文庫的特點1.基因特異性來自結(jié)構(gòu)基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達的基因的遺傳信息2.器官特異性不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。3.代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達亦不相同。

4.不均勻性在同一個cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來的。

5.各cDNA均可獲得表達建立cDNA文庫的一般程序1.mRNA的分離與純化載體DNA片段的制備。2.雙鏈cDNA的合成。

1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法

2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子3.cDNA克隆載體的制備。4.ds-cDNA與載體DNA相連。5.重組cDNA分子的導(dǎo)入和克隆。一、TotalRNA——mRNAmRNA只占總RNA的1%-5%。原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。方法：

寡聚（dT）-纖維素柱層析法。mRNA純化二、cDNA合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。cDNA的第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。禽類成髓細胞瘤病毒（AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶

一類能引起鳥類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。其反轉(zhuǎn)錄酶由一個α亞基和一個β亞基組成，有二種酶活力。1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用。

引物1、OligodT引物2、隨機引物（六聚體寡核苷酸）這種非特異性引物可沿著mRNA多個位點結(jié)合3、特異性引物。反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTT在總的RNA中可作為具有mRNA的特異引物文庫不能完全包含基因編碼序列產(chǎn)生一個大的具有特定序列的cDNA文庫cDNA產(chǎn)物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用可產(chǎn)生大量特定基因的cDNA文庫產(chǎn)生的cDNA文庫應(yīng)用范圍有限

第一鏈合成過程mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物或RNaseH堿第二鏈合成剩下的cDNA單鏈的3’末端可能形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。核酸酶S1cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

cDNA合成缺點：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。

改進RNaseH酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA聚合酶I能除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’

RNaseHDNAligase去引物三、cDNA末端修飾借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。

接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶加人工接頭四、cDNA克隆載體如果用功能測定來篩選目的基因，可用質(zhì)粒載體來構(gòu)建cDNA的表達文庫。如果通過分子雜交或抗體篩選目的基因，可用噬菌體載體構(gòu)建cDNA文庫。λ噬菌體載體－λZapcDNA載體5、Inverse-PCR6、Cross-overPCR例：內(nèi)含子的刪除Pf-1Px-intron2PrPx-intron2exon1FirstroundPCRexon2PrPf-1Anneal(SecondroundPCR)RoAmyX3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、RT-PCR（Reversetranscript）8、Real-timePCR表達型質(zhì)粒如果用功能測定來篩選目的基因，可用質(zhì)粒載體來構(gòu)建cDNA的表達文庫。5’---NGAATTCN---3’剩下的cDNA單鏈的3’末端可能形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用。3’---NCTTAAGN---5’1、OligodT引物通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆2、轉(zhuǎn)化（Transformation）基因的功能基因在染色體上的位置4、目的基因的檢測與鑒定7、Error-pronePCR8、Real-timePCR9、SSH-PCR(suppressionsubtractivehybridization)10、Q-PCR（QuantitativePCR）。。。。。PCR應(yīng)用之目的基因的改造

基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進行基因改造最常用的技術(shù)。最常用方法是以雙鏈DNA為模板，經(jīng)加熱變性后，與含突變堿基的引物退火，利用PCR方法改變特定堿基，從而將突變堿基引入DNA序列中65PCR法（

引物法）設(shè)計引物分段PCR66再次PCR獲得突變基因2024/12/6676.5基因的克隆和表達2024/12/668質(zhì)粒表達型質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)部分基因文庫（如cDNA文庫）5’---NGAATTCN---3’用PCR技術(shù)獲取基因2、PCR原理之DNA物理性質(zhì)5’---NCAGCTGN---3’9、SSH-PCR(suppressionsubtractive基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.（1）從基因文庫中獲取RNaseH酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷?；蛭膸熘邪艘环N生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.hybridization)基因操作技術(shù)的基本原理和步驟3、轉(zhuǎn)染（Transfection）通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆可接雙鏈DNA的平末端、相容粘末端及其中的單鏈切口。常用克隆載體類型：T-載體，pUC系列，pMD系列，一些表達型質(zhì)粒特點：功能單位小，拷貝數(shù)多2024/12/670T-vector2024/12/671BluewhiteScreen2024/12/6722024/12/6736.5.2常用表達系統(tǒng)原核細胞：大腸桿菌、芽孢桿菌等真核細胞：絲狀真菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等2024/12/6746.5.3.原核細胞表達載體pBV220、pET等,多種載體有商品化供應(yīng)原核細胞RNA聚合酶可以識別的啟動子原核細胞轉(zhuǎn)錄終止子原核細胞核糖體結(jié)合位點其他調(diào)控序列結(jié)構(gòu)特點克隆基因在原核生物中表達的必要條件是攜帶克隆基因的載體具備原核生物中所需要的以下表達調(diào)控序列:

75蛋白表達方式表達產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。最后應(yīng)用時，可能需要切除標(biāo)簽部分非融合表達表達產(chǎn)物直接是單一目的蛋白融合表達76原核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點

表達系統(tǒng)簡單，容易操作成本低，易于大量生產(chǎn)生長周期短缺點

需要翻譯后修飾的蛋白不能用此表達系統(tǒng)77真核表達載體

主要包括質(zhì)粒載體和病毒載體，使用的調(diào)控表達元件最初多來源于病毒2024/12/678真核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點表達系統(tǒng)相對復(fù)雜成本高生長周期長優(yōu)點可表達需要翻譯后修飾的蛋白表達系統(tǒng)簡單缺點2024/12/6796.6基因表達載體PgpdA/EcoRIHygro/NotITtrpC/BamHIRoAmy/NheIEcoRI6.7目的基因到宿主細胞過程81oryzaegenomeDNA缺點：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。（bluntend）BluewhiteScreenAnneal(SecondroundPCR)基因工程（geneticengineering）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）---剪1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法1、模板（Templates）通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆流感噬血桿菌種屬d株第三種內(nèi)切酶RoAmy/NheI基因工程（geneticengineering）思考：基因文庫如何構(gòu)建？感受態(tài)細胞（competentcell）使用理化或化學(xué)的方法對受體細胞進行處理或誘導(dǎo)，從而使其處于最適攝取和容納外來DNA的一種生理狀態(tài)。826.7.1DNA轉(zhuǎn)移過程中的幾個概念1、接合（Conjugation）Conjugationisthemechanismbywhichgeneticmaterialistransferredbetweentwobacterialcellsbyplasmids.發(fā)生在原核生物，細胞間的直接接觸時候，兩個細胞直接接觸處形成conjugationtube，單鏈DNA可以直接通過這個通道轉(zhuǎn)移，這個通道的形成需要有相應(yīng)的基因表達（如pilin形成sex