第四章放射自顯影技術(shù)

優(yōu)選第四章放射自顯影技術(shù)當(dāng)前1頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前2頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。放射自顯影技術(shù)當(dāng)前3頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。Northern雜交rat當(dāng)前4頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。brainRadishleaf當(dāng)前5頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前6頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。四、放射自顯影的特點(diǎn)ARG既是一種輻射探測(cè)方法，又是一項(xiàng)完整的同位素示蹤技術(shù)。它與一般用制備的放射性樣品，通過(guò)電離或閃爍探測(cè)器檢測(cè)放射性的示蹤技術(shù)相比，有下列主要優(yōu)點(diǎn)：1、能夠準(zhǔn)確定位

依自顯影的類型不同能檢測(cè)放射性物質(zhì)在器官、組織、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、甚至在生物大分子中的分布。至于用自顯影獲得的細(xì)胞，亞細(xì)胞和分子水平上放射性物質(zhì)的分布是用一般的生物化學(xué)分離法難以獲得或不能獲得的。2、具有很高的靈敏性

因?yàn)檎障嗳槟z對(duì)射線的反應(yīng)具有累積作用，所以通過(guò)延長(zhǎng)曝光時(shí)間可以檢測(cè)到樣品中微弱放射性。3、資料形象，易于保存

獲得的自顯影圖像能清晰反映放射性物質(zhì)在器官、組織、和各結(jié)構(gòu)部位的分布情況，形象、客觀并能長(zhǎng)期保存。當(dāng)前7頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。雖然放射自顯影技術(shù)有著其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但同樣存在一些不足之處：1、自顯影的制備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

手續(xù)較復(fù)雜，尤其顯微自顯影要求較薄的技術(shù)；2、不能直接定量一般情況下只能相對(duì)定量。因此，除了在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中的特殊目的外，在一般的示蹤實(shí)驗(yàn)中，放射自顯影作為放射性檢測(cè)的一種手段，補(bǔ)充提供放射性物質(zhì)的吸收，運(yùn)轉(zhuǎn)和分布的資料。

當(dāng)前8頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。第二節(jié)宏觀放射自顯影（Macro-autoradiography）的制作以宏觀材料制作的自顯影，肉眼或光密度計(jì)觀察組織、器官中放射性物質(zhì)的分布。一、樣品的制備1、植物材料

整株或部分器官（枝條、葉片、花蕾等），壓制成標(biāo)本要求干而不脆，平整。若植株過(guò)大可折轉(zhuǎn)或剪斷。若觀察放射性物質(zhì)在莖桿中的分布，可制成莖桿的縱橫切片。2、動(dòng)物材料

整體切片：縱剖面或橫剖面，或組織的宏觀切片。3、層析譜

紙層或薄層板展開后，充分干燥，可噴射聚氯乙烯或硝化纖維（polyvinylchlorideornituocellalose），以防止自顯影時(shí)薄層板上吸附劑粉的移動(dòng)。4、凝膠電泳塊

為防止水分對(duì)乳膠的影響可采取：（1）干燥；（2）包蔽；（3）冰凍：在低溫條件下曝光。5、其他如土壤剖面，可將土壤切成平整的剖面，用薄的聚氯乙烯膜包蔽。

當(dāng)前9頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。二、自顯影的制作1、感光材料通常為乳膠，其基本組成為溴化銀晶體、支持物、明膠（溴化銀晶體的支持物）。各種感光材料主要由于銀鹽的濃度，結(jié)晶顆粒的大小和乳膠層的厚度不同而具有不同的敏感度和分辨能力，適于不同目的的自顯影。顆粒越大、越多，即越容易形成潛影。而分辨力與顆粒的大小和乳膠層的厚度相關(guān)。照相乳膠的類型有X光片、幻燈片或電影正片、核乳膠、乳膠干板、加強(qiáng)膜（熒光片增強(qiáng)感光）、照相底片。2、自顯影的制作一般采用接觸曝光，將樣本平整的一面與X光片或其它固體照相材料緊密接觸，樣本的另一面填上泡沫塑料等松軟材料。X光片上覆蓋一層薄紙，壓緊，使其和樣本緊密接觸。市售的X光曝光盒底層有泡沫塑料，放一張保護(hù)紙后，放樣本，X光片在樣本上面，再覆蓋保護(hù)紙將蓋子扣緊，就能完全曝光。為防止薄層板上分離的純化學(xué)物質(zhì)或土壤中的化學(xué)物質(zhì)對(duì)感光材料的作用，可再薄層板或剖面上加保護(hù)膜，這對(duì)32P樣品沒(méi)有影響，對(duì)14C、35S等軟β核素，可能將一部分射線擋除，而對(duì)3H則完全把射線隔斷。

當(dāng)前10頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。三、照相過(guò)程1、曝光（1）潛影的形成過(guò)程射線粒子進(jìn)入晶體，能從溴離子中打出電子，形成電子與銀離子的離子對(duì)，只要能量足夠，這個(gè)電子能離開軌道，進(jìn)入導(dǎo)電帶，在晶體內(nèi)移動(dòng)，并移向缺陷處，形成陰電層，銀離子向陰電層移動(dòng)，獲得電子，形成銀原子，銀原子聚集形成潛影。同時(shí)，失去電子的溴離子成為溴原子，并從晶體表面釋放出，跑到明膠中。（2）曝光條件緊密曝光，固定，安全曝光，無(wú)外源放射性，安全位置，別人不會(huì)拿動(dòng)或作上標(biāo)記，濕度不能太高，低溫下能增加敏感度。（3）曝光時(shí)間曝光時(shí)間不足，來(lái)不及形成潛影，不能得到顯影形象。因?yàn)樵谝话泔@影條件下，要使銀粒顯影，需要有一定的銀粒數(shù)及每粒含有一定數(shù)量的銀原子數(shù)。曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本底增加，降低了分辨力，特別是β射線，由于散射使形象模糊。在曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)情況下，有時(shí)感光度反而降低，因?yàn)殂y原子與溴原子重新結(jié)合，稱為潛影衰退（imagefadding）。過(guò)量的水分，大氣中的O2、H2O2過(guò)大或不均勻的壓力，過(guò)高的溫度都能增加潛影衰退。因此在曝光之前必須使乳膠完全干燥，如需長(zhǎng)時(shí)間曝光，可除去空氣，在N2或氬氣中暴光，并且在低溫下進(jìn)行。當(dāng)前11頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前12頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。曝光時(shí)間的長(zhǎng)短和射線的種類(能量、半衰期)、活度和感光材料的類型及自顯影的種類有關(guān)，同時(shí)也要考慮到放射性分布的無(wú)均勻性。對(duì)X-光片，105～106粒/cm2能產(chǎn)生可顯影的潛影，107～1010粒子/cm2產(chǎn)生好的潛影。因此可以此數(shù)除以單位面積樣品的放射性活度（dpm/cm2）來(lái)粗略的估計(jì)曝光時(shí)間（t=(dpm/cm2)/(107～1010粒子/cm2)，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)曝光確定適宜的曝光時(shí)間，即在正式制片的同時(shí)，壓制相同樣品的預(yù)備片，在不同時(shí)間取出顯影，直至出現(xiàn)清晰的圖象。2、顯影

顯影過(guò)程是在顯影劑的作用下，使感光的銀顆粒還原，使?jié)撚帮@現(xiàn)出來(lái)。是一個(gè)自催化的過(guò)程，在還原已開始的晶粒中比還原還沒(méi)有作用的晶粒還原的快，因此在含有潛影銀的晶粒中首先開始作用，溴化銀轉(zhuǎn)化成銀原子，聚積在潛影形成的位置上，溴離子從晶粒中擴(kuò)散出去。在沒(méi)有潛影的銀粒中也能顯影，但要慢的多，顯影要掌握在正好使感光晶粒還原，而未感光的晶粒還未還原，結(jié)果使形象顯示出來(lái)。顯影液一般用D19-6或市售的顯影粉配置。溫度在19±1℃，時(shí)間一般在2～3min。當(dāng)前13頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。3、定影定影劑的主要成分是Na2S2O3（硫代硫酸鈉），目的是去掉未顯影的晶體顆粒，使圖像得以長(zhǎng)久保存。其反應(yīng)式如下：Na2S2O3+AgBr→NaAgS2O3+NaBr；NaAgS2O3+Na2S2O3→Na3Ag(S2O3)2。定影的時(shí)間一般為15min或更長(zhǎng)，溫度控制也沒(méi)有顯影過(guò)程那么嚴(yán)格。定影完成后，充分水洗，除去定影劑和硫化物，然后涼干。當(dāng)前14頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。四、宏觀自顯影（Macor-autoradiography）的觀察1、肉眼觀察觀察發(fā)黑的部位和程度，如果放射性只分布在個(gè)別部位，或放射性比較弱，發(fā)黑不明顯，必須有實(shí)物照片比較觀察。用X－看片燈可以觀察的比較清楚。2、光密度測(cè)量肉眼觀察只能獲得不同器官或組織放射性多少的相對(duì)印象，不能給出具體的數(shù)據(jù)。光密度測(cè)量是用光密度計(jì)測(cè)量透過(guò)部位的光的強(qiáng)弱，對(duì)底片黑化程度能給出定量數(shù)據(jù)。因此能較客觀評(píng)價(jià)各部位、器官、組織的放射性的相對(duì)分布。這種自顯影定量的關(guān)鍵在于制備和應(yīng)用放射性階標(biāo)。即用逐級(jí)降低的已知放射性活度的階梯性標(biāo)準(zhǔn)（簡(jiǎn)稱為放射性階標(biāo)），與待測(cè)樣本一起曝光和加工，通過(guò)與階標(biāo)的黑度相比，來(lái)確定標(biāo)本的放射性（參考王成方等“大豆光合產(chǎn)物運(yùn)轉(zhuǎn)分配的定量自顯影研究”原子核農(nóng)業(yè)應(yīng)用，1985，4：26-29）。由于標(biāo)本各處的組織結(jié)構(gòu)的差異，自吸收及對(duì)乳膠接觸的幾何條件不同，因而必須對(duì)用階標(biāo)法測(cè)出的標(biāo)本的放射性活度進(jìn)行修正后，才是標(biāo)本的實(shí)際放射性活度。即在自顯影后，將標(biāo)本的代表性部位取下，稱量，并液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性，與自顯影片的值相比較，求出R值（R=標(biāo)本液閃測(cè)得放射性活度/自顯影測(cè)得的放射性活度），再進(jìn)行校正。（參見(jiàn)劉鼎新，放射自顯影技術(shù)的一些新進(jìn)展，1980，1，核醫(yī)學(xué)進(jìn)展；RogersA.W.，PracticalAutoradiograph，EnglandReview，1979，（20））。當(dāng)前15頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。第三節(jié)光學(xué)顯微自顯影（IMARG）的制作IMARG是在光學(xué)顯微鏡的水平上觀察放射性物質(zhì)的分布，所用的樣品通常是粘在載玻片上的切片。根據(jù)所研究物的性質(zhì)和觀察的結(jié)構(gòu)部位的大小，制作不同厚度的包埋切片或細(xì)胞涂片。然后在切片上覆蓋乳膠膜。經(jīng)暴光，顯影，定影后，連同切片一起觀察乳膠中的銀粒分布。一、固定和包埋材料及切片的制備1、石蠟包埋切片取新鮮的組織塊（經(jīng)放射性標(biāo)記，0.5cm×0.5cm×0.5cm）→固定（保持新鮮狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，一般采用卡諾氏Ⅰ（96%乙醇：冰醋酸=3：1V/V）或卡諾氏Ⅱ（96%乙醇：氯仿：冰醋酸＝6：3：1V/V/V）固定液固定24小時(shí)，若要保存核蛋白，可采用甲醛：70%乙醇：冰醋酸=5：90：5（V/V/V）固定液）→脫水（用逐級(jí)酒精脫水）→浸透（1/2二甲苯+1/2酒精→二甲苯）→透明（1/2二甲苯+1/2石蠟）→包埋（將融化石蠟中的組織塊，量于用紙折成或特殊的包埋盒內(nèi)的適宜位置，灌入融化石蠟，投入冰水中冷卻）→修塊（將樣本周圍所涂石蠟切掉，修成適宜切片的一定形狀的蠟塊）→切片→展片→脫蠟→復(fù)水→干燥。若要在高倍顯微鏡下觀察，制作0.5～1μm的半薄切片，則采用樹脂包埋。其處理過(guò)程與上述基本相同，但要求更精細(xì)的操作，要用性能良好的切片機(jī)和玻璃刀。當(dāng)前16頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。呈淡黃色，在常溫呈牛乳狀，平時(shí)必須保存于4～8℃冰箱中。它反映可在所有條件下銀粒的分布，也適用于任何核素。采取后染色是防止照相過(guò)程對(duì)染色劑的影響，及染色劑對(duì)乳膠的影響。當(dāng)前9頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前32頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。因?yàn)樵谝话泔@影條件下，要使銀粒顯影，需要有一定的銀粒數(shù)及每粒含有一定數(shù)量的銀原子數(shù)。如果顯影時(shí)間太短，難以控制，可將顯影液稀釋，延長(zhǎng)顯影時(shí)間，減少操作誤差。2、自顯影的制作一般采用接觸曝光，將樣本平整的一面與X光片或其它固體照相材料緊密接觸，樣本的另一面填上泡沫塑料等松軟材料。中能量射線作用于乳膠，而在曝光時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，乳膠受到高能核射線作用時(shí)間隨之增加，因而使分辨力下降。吉林農(nóng)科院：在廣口熱水瓶中放入干冰，在有膠塞的試管中充入經(jīng)無(wú)水硫酸鈉反復(fù)脫水和蒸餾后的純丙酮，插入干冰中預(yù)冷。對(duì)X-光片，105～106粒/cm2能產(chǎn)生可顯影的潛影，107～1010粒子/cm2產(chǎn)生好的潛影。當(dāng)前19頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。它與一般用制備的放射性樣品，通過(guò)電離或閃爍探測(cè)器檢測(cè)放射性的示蹤技術(shù)相比，有下列主要優(yōu)點(diǎn)：以宏觀材料制作的自顯影，肉眼或光密度計(jì)觀察組織、器官中放射性物質(zhì)的分布。這些都會(huì)使分辨力降低。2、冰凍切片冰凍切片用以研究可溶性的小分子放射性成分的分布，必須將新鮮組織塊量于液氮冷卻的異戊烷或丙烷中或干冰丙酮中快速冷凍，固定活體結(jié)構(gòu)，防止冰晶形成，然后以不同方法進(jìn)一步處理。（1）組織塊處理①凍干－滲蠟首先深凍組織塊，低溫真空干燥，通過(guò)升華使組織脫水；然后真空滲蠟：凍干組織塊置于試管固體石蠟上，抽真空后，在60℃水浴滲蠟。②冷凍取代用有機(jī)溶劑取代水分子而使組織脫水。吉林農(nóng)科院：在廣口熱水瓶中放入干冰，在有膠塞的試管中充入經(jīng)無(wú)水硫酸鈉反復(fù)脫水和蒸餾后的純丙酮，插入干冰中預(yù)冷。速凍的組織塊于低溫干燥條件下迅速轉(zhuǎn)入試管中，密封。并置于冰箱中，每天加干冰，一周后，拉試管膠塞于冰面中，自然升溫至室溫，取代完畢。（2）恒冷切片箱中切片冰塊裝于恒冷箱切片機(jī)上，在低溫下切片，切片浮于益玻片上，再將蓋玻片于黑暗中沾于乳膠干板上，在低溫下曝光，即為融表法。

當(dāng)前17頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。二、顯影的制作1、固體乳膠法在低溫顯微鏡下觀察比較厚的組織切片的自顯影，可用電影正片、幻燈片、乳膠干板或涂有液體乳膠膜的玻片，可用下列方法制備自顯影：（1）接觸法

（2）濕貼法

（3）濕貼-接觸法

2、液體乳膠法將核乳膠于40-50℃水浴中融化，稀釋，輕輕攪拌均勻，用涂布法，滴加法，常用浸蘸法制備乳膠膜覆蓋于切片上，待乳膠冷卻、凝固、干燥后，置于暗盒中，加入干燥劑，黑紙包裹。為防止脹力顯影，干燥過(guò)程不要太快。核乳膠是對(duì)射線敏感，對(duì)普通光線相對(duì)不敏感，專為自顯影而制造的照相乳膠。呈淡黃色，在常溫呈牛乳狀，平時(shí)必須保存于4～8℃冰箱中。3、揭膜法揭膜乳膠如AR-10是10nm的明膠層上加一層5μm的乳膠層，使用時(shí)將其從玻片上連同明膠一起揭下來(lái)，漂浮于25℃蒸餾水中，將玻片插入水中，切片朝上，對(duì)準(zhǔn)乳膠膜，將其置于標(biāo)本上。揭膜法的優(yōu)點(diǎn)是厚度一致，重復(fù)性好。但由于明膠層的覆蓋，增加染色的困難。

當(dāng)前18頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。三、照相過(guò)程1、曝光曝光時(shí)間一般為兩周左右，正確的曝光時(shí)間憑經(jīng)驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)曝光確定。即制備一些同樣的實(shí)驗(yàn)切片，間隔一定時(shí)間抽出2～3片顯影、定影，直至清晰的自顯影圖象出現(xiàn)，再把全部材料顯影。曝光條件：除宏觀自顯影的條件外，要求乳膠充分干燥，低溫下曝光（4℃左右）。要注意是否有潛影衰退，防止化學(xué)顯影及張力顯影。2、顯影顯影時(shí)間以乳膠種類，顯影劑和觀察方法等確定。一般D+19b，在19±1℃條件先顯影，顯影時(shí)間掌握在由樣品放射性產(chǎn)生的粒子和本底粒子數(shù)最佳比例，核乳膠一般為3～5min。測(cè)試者，必須制備好一些片子，摸索適宜的顯影時(shí)間。如果顯影時(shí)間太短，難以控制，可將顯影液稀釋，延長(zhǎng)顯影時(shí)間，減少操作誤差。反之，可增加顯影劑濃度，縮短顯影時(shí)間。同時(shí)，在顯影時(shí)，要注意顯影劑的攪動(dòng)。3、定影

顯影后經(jīng)蒸餾水或1%醋酸液，再放入F-5定影液中，15min后，取出用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次，染色后，封片。當(dāng)前19頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。四、光學(xué)顯微自顯影的觀察與分析1、粒子計(jì)數(shù)首先要識(shí)別銀粒，區(qū)別于染料及塵埃等沾染物。顯影銀粒在光學(xué)顯微鏡水平上，在投射光視野下觀察呈黑色圓子。在落射光暗視野下反射為亮點(diǎn)。一般在投射光明視野中就能識(shí)別。在一定銀粒密度限度內(nèi)，銀粒數(shù)和乳膠所感受的放射性呈正比。所以在顯微鏡測(cè)數(shù)視野中，對(duì)一定面積或一定細(xì)胞器的顯影銀粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，按銀粒的多少，確定或比較各部位所感受的放射性。在比較不同結(jié)構(gòu)部位的放射性時(shí)，如屬于同一種結(jié)構(gòu)類型，或標(biāo)記后不同時(shí)間蛋白質(zhì)或核酸合成情況，此情況下，只要嚴(yán)格控制切片和乳膠的厚度、源大小、形狀、密度、與乳膠的幾何形狀是相同的，這樣，粒子數(shù)與源的放射性呈很好的正比關(guān)系。但如果銀粒密度超過(guò)一定范圍，非但不易計(jì)數(shù)，而且存在著顆粒感光后被重復(fù)擊中的可能，使得正比關(guān)系變差。對(duì)于不同類型的源，形狀、大小、密度和幾何位置不同，比較就很困難，對(duì)相鄰近不同源的粒子進(jìn)行成對(duì)計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行t－實(shí)驗(yàn)，就能減少這種誤差。2、徑跡計(jì)數(shù)電離粒子通過(guò)乳膠時(shí)，在它的途徑上會(huì)產(chǎn)生多個(gè)銀粒子，以特定的方式排列，形成徑跡。因一個(gè)徑跡代表一個(gè)離子粒子，故根據(jù)徑變數(shù)可以測(cè)量來(lái)自樣品的粒子數(shù)。3、反射光光度測(cè)定根據(jù)銀粒在暗視野中反射光的特性，用顯微鏡光度計(jì)測(cè)定所反射的光，可迅速而準(zhǔn)確的測(cè)定乳膠的輻射效應(yīng)。需要一個(gè)顯微光度計(jì)，一個(gè)垂直落射的照相器及一個(gè)穩(wěn)定的電源。4、乳膠光密度測(cè)量核乳膠由于源的放射性作用產(chǎn)生銀粒，而降低了透光性，其光密度和輻射性成正比。所以可用顯微光密度計(jì)測(cè)量乳膠層的光密度，來(lái)測(cè)量乳膠衰變的放射性劑量。

當(dāng)前20頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。第四節(jié)電鏡顯微自顯影（EMARG）的制作以超薄切片為材料，涂上單層乳膠膜，在電鏡下觀察的放射性物質(zhì)在超微結(jié)構(gòu)中的分布或生物大分子的標(biāo)記部位，所以是亞顯微或分子水平上的放射自顯影。在切片的制作，單層乳膠膜的制作及觀察與分析方面，要求更高的技術(shù)。一、超薄切片的制作不同顯微切片的厚度：光學(xué)顯微自顯影用厚切片：3-20μm；石蠟切片：3-5μm；冰凍切片：10μm。高倍顯微鏡：用樹脂切片：1-0.5μm；電鏡觀察的超薄切片在0.1μm以下，一般為0.06μm。超薄切片的制作程序與石蠟切片的基本相同，不同的是制作超薄切片時(shí)用戊二醇和鋨酸進(jìn)行雙固定，以環(huán)氧樹脂或甲基丙烯酸脂為包埋劑，用超薄切片機(jī)或玻璃刀切成0.1μm以下的超薄切片，一般為0.06μm的厚度。過(guò)程如下：采樣（1mm3）→固定→脫水→環(huán)氧丙烷處理兩次→滲透（1/2環(huán)氧丙烷+1/2包埋劑）→包埋→超薄切片→用玻璃刀切片（約0.06μm）→切片漂于水滴上→沾于涂有化棉膠膜的銅網(wǎng)上→無(wú)塵空氣中干燥→噴碳膜（50—60?）（看前染，去噴碳膜之前用重金屬鹽進(jìn)行電子染色）。當(dāng)前21頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。二、自顯影的制作電鏡自顯影的特點(diǎn)是切片很薄，樣品量少，源和要求觀察的分辨力高。因此對(duì)感光膜有特殊要求：乳膠層必須是單分子層，也就是AgBr顆粒不重疊，其厚度即為AgBr顆粒的直徑（0.15m以下）；AgBr顆粒要細(xì)而均勻，密度要大，基本上鋪滿單分子層；膜堅(jiān)固，能耐受電子轟擊。單層乳膠膜的制作方法：1、金屬環(huán)套法（wireloopmethod）乳膠45℃融化→無(wú)離子水稀釋→45℃保溫15min→冰浴3min→室溫靜止10～15min，使成半凝膠狀態(tài)→將100p往乳膠中一浸取出，在紅燈下檢查乳膠的凝膠狀態(tài)，并確定為單分子層→覆蓋于銅網(wǎng)切片上。單分子層：環(huán)中的乳膠膜若較快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即膜厚薄均勻，很少流動(dòng)，則表明乳膠已達(dá)理想狀態(tài)，就可使用。2、浸液法將乳膠融化，用水稀釋，調(diào)勻→在蒸餾水表面制火棉膠膜或帶帶福爾馬林膜，載有切片的銅網(wǎng)板上，用玻片往上一撈，涼干，在貼有銅網(wǎng)的玻片往乳膠液一浸，提起，瀝去多余乳膠，涼干。3、其他方法平板法或涂布法等。當(dāng)前22頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。三、照相過(guò)程1、曝光將銅網(wǎng)量于塑料暗盒，充分干燥后，放入干燥劑，黑紙包封，已4℃水箱中曝光。時(shí)間一般為同樣IMARG的10倍左右。為了準(zhǔn)確掌握曝光時(shí)間，每隔1～2周，取1～2個(gè)銅網(wǎng)檢查。2、顯影D19-6；18-20℃；顯影2-4min；1%醋酸停顯。3、定影用25～30%硫代硫酸鈉定影→無(wú)離子水漂洗→無(wú)塵空氣中涼干。4、后處理固明膠的存在，減少了EMARG的反差，需要除去明膠，再用醋酸鈉和檸檬酸鉛進(jìn)行染色，染色時(shí)間可比通常的要短。采取后染色是防止照相過(guò)程對(duì)染色劑的影響，及染色劑對(duì)乳膠的影響。當(dāng)前23頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。第五節(jié)與放射自顯影質(zhì)量有關(guān)的幾個(gè)因素一、各種核射線在乳膠中的徑跡各種射線α、β、γ、質(zhì)子、中子，在厚層乳膠中所留下的徑跡是不同的（表4-1）。α粒子具有較大的質(zhì)量而運(yùn)動(dòng)速度小，所以對(duì)乳膠表現(xiàn)出很強(qiáng)的電離作用。它4徑績(jī)直，密度均勻，所得自顯影像最為清晰，但有生物學(xué)意義得元素都不是α粒子得輻射體。β粒子得徑跡復(fù)雜，因?yàn)樗芰啃?，電離密度比α粒子低。在路徑上易受原子作用引起傾斜，所以在乳膠中容易彎曲的徑跡。β粒子在乳膠中射程因能量不同（如32P>35S>14C>3H）所以其徑跡長(zhǎng)度也不相同。農(nóng)業(yè)生物學(xué)中應(yīng)用的放射性核素，大多數(shù)是β輻射體。γ射線質(zhì)量小，能量高，散射強(qiáng)，穿透力強(qiáng)，而對(duì)乳膠作用極小，在乳膠不留徑跡。所以，純?chǔ)蒙渚€的核素不能用于放射性自顯影，但是值得注意的是在以電子俘獲或內(nèi)轉(zhuǎn)換電子衰變方式的核素中能放出俄歇電子，這些俄歇電子能量較低，能夠得到清晰的徑跡。當(dāng)前24頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。表4-1放射性自顯影中使用的幾種放射性核素

核素半衰期β能量（mer）γ能量乳膠中射程（μ）平均最大平均最大3H12.3（a）0.0050.018

1614C5568（a）0.050.155

1512035S87.1（d）0.0550.167

2014032P14.3（d）0.6951.701

1400400045Ca164（d）0.1000.255

50220131I8.05（d）0.2050.608

160100058Fe47.0（d）0.1200.461.106050086Rb18.7（d）

1.771.08

22Na2.62（d）

0.541.28

42K12.4（d）

3.54

0.981.52

當(dāng)前25頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。二、放射自顯影的本底1、定義在黑暗條件下沒(méi)有放射性樣本的乳膠或樣本以外的乳膠部位或沒(méi)有放射性的樣本部位，乳膠顯影以后也產(chǎn)生銀粒而使乳膠發(fā)黑，這種與樣本的放射性無(wú)關(guān)的底片發(fā)黑和顯影顆粒成為放射自顯影的本底。2、本底產(chǎn)生原因（1）顯影過(guò)度黑暗即顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使未感光的晶粒還原，超過(guò)適宜的時(shí)間，本底增加很快。超過(guò)適宜的溫度也增加本底。（2）光暗室紅燈過(guò)亮，曝露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或曝光期間，黑暗條件不嚴(yán)密或漏光，使乳膠感光產(chǎn)生本底。（3）外源放射性

自然界的宇宙射線和本底放射性產(chǎn)生的本底是不可避免的。但要除去任何人為的外源放射性對(duì)本底的影響。（4）乳膠本身乳膠存放時(shí)間太長(zhǎng)，超過(guò)有效期，或存放不當(dāng)使乳膠感光或污染均會(huì)使乳膠的本底增加。當(dāng)前26頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。（5）機(jī)械壓力或張力核乳膠對(duì)機(jī)械壓力很敏感，操作時(shí)必須避免劃痕、指印或擠壓，使底片受壓力均勻。微觀自顯影因?yàn)闃悠分胁煌Y(jié)構(gòu)處乳膠層厚薄不均勻，干燥過(guò)程中產(chǎn)生脹力也能產(chǎn)生顯影銀顆粒，這種顯影顆粒往往呈結(jié)構(gòu)形式分布而被誤認(rèn)為是由放射性而產(chǎn)生的，稱為脹力假象（pressureartifacts）。為防止脹力顯影，切片的質(zhì)量要好，乳膠膜厚薄盡量均勻，干燥不要過(guò)快。（6）化學(xué)物質(zhì)乳膠對(duì)樣品中存在的化學(xué)物質(zhì)也很敏感，特別是還原劑，因?yàn)樗鼈兺式Y(jié)構(gòu)形式分布，所以也能產(chǎn)生假象，稱為化學(xué)假象（chemogrephy）。還原劑產(chǎn)生的是正的化學(xué)顯影（positivechemography），如存在氧化劑，能引起潛影衰退，稱為負(fù)的化學(xué)顯影（negativechmography）。當(dāng)前27頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。3、本底的檢查和防止

除了宇宙射線，本底放射性，乳膠和樣本本身的本底外，均可以通過(guò)小心操作，把本底控制在最低程度。至于化學(xué)顯影可以設(shè)置對(duì)照樣本檢查并采取防止措施。

當(dāng)前28頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。三、放射自顯影的分辨力自顯影的分辨力不同于光學(xué)上的分辨力，不是指兩個(gè)結(jié)構(gòu)點(diǎn)能被區(qū)分的最小距離，而是表示自顯影像與樣品的標(biāo)記結(jié)構(gòu)符合的程度。在宏觀自顯影中是以兩個(gè)特定大小的源能級(jí)區(qū)分的最小距離來(lái)衡量。在微觀自顯影中以源周圍銀粒的分布來(lái)衡量。即：概念上不是指自顯影所能分辨的兩個(gè)放射源間的最小距離或最小放射源的大小，而是從自顯影像上銀粒的分布來(lái)分析放射源所在的位置，即是自顯影與標(biāo)本中標(biāo)記結(jié)構(gòu)相互關(guān)系的一種度量。對(duì)于一個(gè)點(diǎn)狀放射源來(lái)說(shuō)，銀粒在源周圍呈輻射狀分布，源上銀粒密度最大，隨著離源距離的增加，銀粒密度迅速減少。對(duì)于一個(gè)線狀放射源，銀粒在源兩邊呈對(duì)稱分布。若通過(guò)源劃一條線，以這條線為橫坐標(biāo)，以離源的距離對(duì)銀粒密度或銀粒數(shù)作圖，得到的圖6-2和圖6-3即為銀粒密度曲線和銀粒分布曲線。

當(dāng)前29頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前30頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前22頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前37頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。顆粒越大、越多，即越容易形成潛影。如果顯影時(shí)間太短，難以控制，可將顯影液稀釋，延長(zhǎng)顯影時(shí)間，減少操作誤差。5～1μm的半薄切片，則采用樹脂包埋。1、感光材料通常為乳膠，其基本組成為溴化銀晶體、支持物、明膠（溴化銀晶體的支持物）。第二節(jié)宏觀放射自顯影（Macro-autoradiography）的制作當(dāng)前19頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。要注意是否有潛影衰退，防止化學(xué)顯影及張力顯影。一、固定和包埋材料及切片的制備1、乳膠中溴化銀粒的大小不同類型乳膠中溴化銀顆粒大小不同，一般說(shuō)顆粒大敏感度高，而分辨力低，顆粒小則敏感度低而分辨力高。對(duì)于一個(gè)線狀放射源，銀粒在源兩邊呈對(duì)稱分布。，PracticalAutoradiograph，EnglandReview，1979，（20））。表4-3不同核素的自顯影效率（AR-10膠片）4、樣本與乳膠層的距離樣本與乳膠層距離越大，分辨力越差，影像越不清楚。由于很難測(cè)定由放射性產(chǎn)生的銀粒分布的端點(diǎn)，故必須采用其它參數(shù)來(lái)定義分辨力。L.achmann和M.M.Salpeter（1965）將包含源產(chǎn)生的總銀粒數(shù)的一半的以點(diǎn)源為中心的源的半徑（半半徑，HR）定義為分辨力。對(duì)于線源，則將包含源產(chǎn)生的銀顆粒的一半時(shí)任何一邊離源的距離，稱為半距離（HD）。HD隨樣品厚度、乳膠層的厚度、晶體顆粒的大小等變化，但若以HD為單位，對(duì)源周圍的銀粒分布做曲線，則在所有情況下都具有相同形狀的曲線，因而產(chǎn)生了萬(wàn)能曲線。它反映可在所有條件下銀粒的分布，也適用于任何核素。利用萬(wàn)能曲線可以通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)預(yù)測(cè)各種形狀的源周圍的粒子分布（圖6-4）。就單像來(lái)說(shuō)，分辨力所給的定義是以銀粒密度最大的點(diǎn)與銀粒密度減少一半的點(diǎn)之間距離（稱為半距離HD）來(lái)表示。HD數(shù)值越小表示分辨力越高，所得到影響越清晰。反之分辨力就低，影像模糊，難以區(qū)分(表6－2)。

當(dāng)前31頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。當(dāng)前32頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。表4-2乳膠厚度、樣品厚度、樣品－乳膠距離與分辨力

乳膠厚度樣品厚度樣品－乳膠距離分辨力2202.1220.53.45505.1550.56.420509.32050.520.6當(dāng)前33頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。影響分辨力的因素主要有以下幾個(gè)方面：1、乳膠中溴化銀粒的大小

不同類型乳膠中溴化銀顆粒大小不同，一般說(shuō)顆粒大敏感度高，而分辨力低，顆粒小則敏感度低而分辨力高。專用的核乳膠，顆粒小、敏感度高，故多用于微觀自顯影，電鏡自顯影則要求更細(xì)的銀粒。在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)盡可能采用細(xì)顆粒乳膠。2、乳膠厚度

乳膠層薄則分辨力高，反之乳膠層厚分辨力底。在電鏡自顯影時(shí)基本要求用單層銀粒乳膠膜。但要注意到在被采用乳膠薄膜時(shí)，被射線作用的銀粒會(huì)減少，故需延長(zhǎng)曝光時(shí)間，或提高試驗(yàn)樣品中示蹤劑的數(shù)量。3、樣本厚度

樣本厚者，組織層次重疊，不同層次放出射線與乳膠中銀粒作用后，使作用銀粒子重疊，而降低分辨力。4、樣本與乳膠層的距離樣本與乳膠層距離越大，分辨力越差，影像越不清楚。反之越近越好。最為理想的是樣本與乳膠密接在一起。當(dāng)前34頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。5、示蹤核素的能量能量高的核素放射出的核射線的射程較長(zhǎng)，會(huì)使放射源位置以外的銀粒子也受作用，以至使分辨力降低。在條件完全相同情況下，3H、14C、32P的分辨力依次降低，因此在試驗(yàn)?zāi)康脑试S范圍內(nèi)盡量采用能量較低的核素。6、曝光時(shí)間曝光時(shí)間過(guò)度延長(zhǎng)，分辨力則會(huì)下降。因?yàn)樵谡Ｆ毓鈺r(shí)間內(nèi)，主要是示蹤核素中低。中能量射線作用于乳膠，而在曝光時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，乳膠受到高能核射線作用時(shí)間隨之增加，因而使分辨力下降。所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模烙?jì)樣本中示蹤劑分布差異的狀況，選擇適宜的曝光時(shí)間。7、顯影顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本地增加，甚至出現(xiàn)霧翳。如顯影液中含堿性試劑較多，會(huì)使顆粒膨脹、集結(jié)。這些都會(huì)使分辨力降低。所以要注意顯影劑選擇和確定適當(dāng)?shù)娘@影時(shí)間。8、翳(yi)霧和本底翳霧和本底會(huì)使影像與背景模糊不清，降低分辨力。當(dāng)前35頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。四、自顯影的效率自顯影效率是反映曝光期間離開源的β粒子數(shù)與乳膠上產(chǎn)生的銀粒數(shù)之間的關(guān)系，也即曝光時(shí)間乳膠對(duì)應(yīng)于樣品的放射性衰變數(shù)的反應(yīng)。定義為樣品中每100次衰變產(chǎn)生的銀粒數(shù)。它受下列因素的影響。1、核素種類型(表4-3)2、樣品的厚度由于自吸收的影響，顯影顆粒的數(shù)目，并不隨著放射源的加厚呈直線的增加。這說(shuō)明自吸收降低了自顯影的效率。在生物樣品中自吸收大小，主要由射線的能量決定的，如32P發(fā)出的β粒子能量高，5μm厚的切片是無(wú)限?。欢?H發(fā)射的β粒子能量低，5μm的切片厚度就無(wú)限厚了；14C發(fā)射β粒子在1、5、10μm切片中透過(guò)率分別為94.5％，82.5％和70.3％。當(dāng)前36頁(yè)，共43頁(yè)，星期日。NaAgS2O3+Na2S2O3→Na3Ag(S2O3)2。（2）光暗室紅燈過(guò)亮，曝露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或曝光期間，黑暗條件不嚴(yán)密或漏光，使乳膠感光產(chǎn)生本底。2、顯影顯影過(guò)程是在顯影劑的作用下，使感光的銀顆粒還原，使?jié)撚帮@現(xiàn)出來(lái)。這