化學品 分配系數（正辛醇-水）高效液相色譜法試驗 征求意見稿

1GB/T21852—XXXX化學品分配系數（正辛醇-水）高效液相色譜法試驗本文件描述了分配系數（正辛醇-水）的高效液相色譜（HPLC）法試驗的試驗原理、受試物信息、參比物質/參比物、試驗準備、試驗程序、質量保證與質量控制、數據與報告。本文件適用于測定lgPow值為0～6范圍內化學物質的分配系數，特殊情況下也可擴展至lgPow為6~10的化學物質；不適用于強酸、強堿、金屬絡合物、與洗脫液發(fā)生反應的化學物質和表面活性劑。~2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21855化學品與pH有關的水解作用試驗GB/T21853化學品分配系數（正辛醇-水）搖瓶法試驗3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1分配系數partitioncoefficient受試物在互不相溶的兩相介質中達到平衡時的濃度之比。3.2正辛醇-水分配系數octanol-waterpartitioncoefficient受試物在正辛醇-水兩相介質中達到平衡時的濃度之比，以Pow表示。Pow無量綱，通常用以10為底的對數（lgPow）表示。4試驗原理反相HPLC法是在填充鍵合了長烴鏈（如C8、C18）硅膠固定相的分析柱上進行分離的過程。受試物進入色譜柱后，隨著流動相沿色譜柱運動的同時，在溶劑流動相和烴類固定相之間進行分配。化學物質在柱中的保留值與其烴-水分配系數成比例，親水性化學物質先洗脫，親脂性化學物質后洗脫。保留時間以容量因子k表示，見式（1）。k=………………………（1）2GB/T21852—XXXX式中：tR——受試物的保留時間，單位為min；t0——死時間，即溶劑分子通過分析柱的平均時間，單位為min。本方法無需定量的分析方法，只需測定保留時間值。受試物的正辛醇-水分配系數可通過實驗測得其容量因子k，代入式(2）計算得出。lgPow=a+b×lgk……………………（2）式中：Pow——正辛醇-水分配系數，無量綱；a,b——線性回歸系數式（2）可由參比物的lgPow對參比物的lgk作線性回歸所得。對于離子型化學物質可測定其在非離子形態(tài)（游離酸或游離堿）下的分配系數，此時試驗介質為適當的緩沖液。對于游離酸，緩沖液的pH值低于pKa；對于游離堿，緩沖液pH值高于pKa。如果lgPow值用于環(huán)境危害分級或環(huán)境風險評估，則試驗應在相應的環(huán)境pH值范圍內，即pH值為5.0～9.0條件下進行。受試物中如有雜質，將影響色譜峰的準確歸屬，因此干擾結果分析。對于色譜峰不能完全分離的混合物，應記錄lgPow值的上下限和每個lgPow值所對應色譜峰的面積百分比。如果混合物是一組同系物，應計算其lgPow的加權平均值，以每個Pow值所對應色譜峰的面積百分比來計算。所有占總面積百分比不小于5%的色譜峰，均應納入計算(9)，見式（3）。…………………式中：X——lgPow的加權平均值，無量綱；lgPowi——第i個組分的lgPow值，無量綱；Ai——第i個組分的色譜峰面積；A——所有占總面積不小于5%的色譜峰的面積總和。5受試物信息5.1在試驗前，應掌握受試物的下列必備信息：a)解離常數；b)結構式；c)流動相中溶解度。5.2按照GB/T21855的方法測定的水解作用。6參比物質/參比物3GB/T21852—XXXX為了建立受試物的測定容量因子k與其Pow的相關性，需至少用6個點繪制校準曲線。因此應選擇合適的參比物。選用的參比物的lgPow應涵蓋受試物的lgPow值，即至少有一個參比物的Pow數值大于受試物Pow值，另一個參比物的Pow數值小于受試物Pow值，特殊情況下可用外推法。宜選擇與受試物結構相關的物質作為參比物。用于校準的參比物的lgPow值應為可靠的試驗數據。對于lgPow≥4的受試物，如不能獲得可靠的試驗數據，可采用計算值。若使用外推值，則極限值應予以注明。若無與受試物結構相關物質的分配系數數據，可采用其他參比物建立校準曲線。推薦的參比物及其Pow值見附錄A。對于離子化物質，表中的數據為其非離子型的數值。7試驗準備7.1液相色譜儀配有低脈沖泵和匹配的檢測系統的液相色譜儀。紫外（UV）-可見檢測器（測定波長210nm）或折光指數（RI）檢測器可于測定多族化學基團。固定相中極性基團的存在，將嚴重影響液相色譜柱的柱效，因此固定相極性基團的含量應盡可能低。可用商品化的微粒反相填充柱和快速填充柱。在進樣系統和分析柱間加保護柱。7.2色譜柱分析柱填充的固定相為可商品化的鍵合了長烴鏈（如C8、C18）的硅膠柱。7.3試驗條件試驗期間溫度變化不大于±1℃。7.4流動相用HPLC級甲醇和蒸餾水或去離子水配制流動相，在使用前進行脫氣。測定在等度洗脫條件下進行。甲醇-水混合液中水的比例不低于25%。通常甲醇：水體積比(v/v)為3:1的混合液，在流速1mL/min條件下，可在1h內將lgPow值為6的化學物質洗脫。對lgPow>6的化學物質，可通過降低流動相的極性或縮短色譜柱長度縮短洗脫時間。受試物與參比物在流動相中有足夠的溶解濃度以達到測定要求。只有在例外情況下，甲醇-水混合液中可加入附加劑，因附加劑將改變分析柱的性質，因此使用前應確認受試物和參比物的保留時間不受影響。若甲醇/水洗脫體系不能達到試驗要求，則可選用其他有機溶劑-水混合洗脫系統，如乙醇-水、乙腈-水或異丙醇(2-丙醇)-水等。對于離子型受試物，洗脫液的pH值是試驗的關鍵，應保持在色譜柱工作的pH范圍內（通常為2~8）。宜使用緩沖液保持pH。當以有機相-緩沖液為流動相時，注意避免鹽沉淀和色譜柱的性能退化。堿性流動相可引起色譜柱性能的急速衰減，因此使用硅膠柱測定時，流動相pH值不應高于8。7.5試驗溶質受試物與參比物應具高純度，以便在色譜圖中易于分辨目標色譜峰。推薦將受試物與參比物溶解于流動相中，若用其他溶劑溶解受試物與參比物，則最終進樣所用試驗溶液應用流動相稀釋。8試驗程序4GB/T21852—XXXX8.1分配系數的預估測受試物的分配系數可由計算方法（見附錄B）或其在純溶劑中的溶解度比值估算。8.2死時間t0的測定死時間t0可用在色譜柱上無保留的有機物（如硫脲、甲酰胺等）測得。更為精確的死時間可由測定一組同系物（如正烷基甲基酮）中7個化學物質的保留時間值得到。保留時間tR（nc+1）是依據tR（nc）描繪的曲線，這里nc為碳原子的數目。通過實驗結果可得到一條直線，見式（4）。tR（nc＋1AtR（nc1－A）t0（4）式中A代表k（nc+1）/k(nc)，為一常數，死時間t0可從截距（1－A）t0和斜率A求得。8.3回歸方程選取適宜的參比物，以其lgk對lgP作圖。參比物的lgP值應與目標受試物的lgP值相近。測定時，6至10種參比物同時進樣，測定保留時間。建議記錄儀與檢測器系統相聯。用所得相應的容量因子k的對數lgk對lgP作圖?？紤]柱效變化的影響，按一定的時間間隔做回歸方程，至少一天一次。8.4受試物Pow的測定受試物以最小可檢測量進樣。保留時間做兩次平行測定。受試物的分配系數用插值法將計算的容量因子帶入校準曲線所得。很高和很低的分配系數由外推法計算，在這種情況下應注意要標明回歸直線的置信區(qū)間。如果受試物的保留時間值超出了參比物保留時間值的范圍，應列出極限值。9質量保證與質量控制為提高測定的可信度，應進行平行試驗。試驗有效性應滿足以下條件：a）重復性：在相同測定條件下、選用同一組參比物重復測定的lgPow值，變化范圍在±0.1lg單位；b）復現性：如果在選用不同組參比物的條件下重復測定，則結果是不同的；c）典型情況下，一組受試物其lgk與lgPow的相關系數R約為0.9，相當于lgPow（正辛醇-水分配系數）的偏差在±0.5之內；d）多實驗室間的比對試驗表明，HPLC方法測得的lgPow值與按照GB/T21853的方法測定的lgPow值差異在±0.5lg單位之間(2)。通過由結構相關參比物得到的校準曲線，可得到最為準確的結果。10數據與報告試驗報告中應包括以下內容：a)如果估算分配系數，則記錄估算值和所用方法；如果用計算方法，則應充分記錄包括數據庫認證和所選擇的碎片的詳細信息；b)受試物與參比物：純度、結構式和CAS號；c)實驗儀器與操作條件：分析柱、保護柱；d)流動相、檢測方法、溫度范圍和pH；e)洗脫譜圖（色譜圖）；f)死時間及其計算過程；5GB/T21852—XXXXg)保留值數據和從文獻中引用的用于計算的參比物的lgPow值；h)擬合回歸直線（lgk對lgPow)的詳細信息和相關系數，包括置信區(qū)間；i)平均保留值數據和受試物內插lgPow值；j)如果受試物為混合物：已歸屬的洗脫色譜圖；k)對應于lgPow值色譜峰的面積百分比；l)用回歸直線的計算；m)必要時，計算lgPow值的加權平均值。6GB/T21852—XXXX推薦的參比物本文件推薦的參比物見表A.1表A.1推薦的參比物lgPowpK123456789Methylbenzoate苯7GB/T21852—XXXXlgPowpK萘62,4-二硝基-6-仲丁基酚菲注：表中數據的真實性和數據質量，在多實8GB/T21852—XXXXPow的計算方法該附錄簡要介紹了Pow的計算方法。Pow的計算值主要用于以下幾個方面：a)決定所采用的實驗方法：GB/T21853的方法適用于lgPow值在-2~4之間的受試物；高效液相色譜（HPLC）法適用于lgPow值在0~6之間的受試物；b)使用HPLC法時選擇條件（參比物，甲醇/水配比）；c)檢查由實驗方法得到的數值的合理性；d)評估什么時候實驗方法不能應用。B.2計算方法的原理計算方法是根據分子的理論碎片原理。分子斷裂成適當的亞結構后，已知這些亞結構可靠的lgPow值。通過對碎片值求和對分子內作用修正后得到lgPow。B.3計算值的可靠性有一個或兩個功能團的簡單分子，用碎片法和實測法得到的結果偏差在0.1lgPow~0.3lgPow單位之間。誤差幅度取決于所用碎片常數的可靠性、識別分子內相互作用的能力（如氫鍵）和修正項的正確應用。對于離子化學物質，應考慮電荷和解離度帶來的影響。a）Fujita-Hanschπ法最先由Fujita等人引入的疏水性取代基常數π定義如公式（B.1）：πX＝lgPow（PhX）－lgPow（PhH）(B.1)式中：PhX——芳香族化合物的衍生物；PhH——母體化合物。例如：πCl＝lgPow（C6H5CllgPow（C6H62.84－2.13＝0.71π法主要針對芳香族化合物。b）Rekker法應用Rekker法(8)，lgPow值按公式（B.2）計算：lgPow=Σiaifi+ΣA(B.2)式中：A——相互作用項；ai——存在于分子中碎片的數目；fi——碎片的lgPow的增加量。相互作用項以一個單一常數Cm(又稱萬能常數)的整倍數表示。Cm和碎片常數fi可由825個化學物質的1054個實驗Pow值利用多重回歸分析而測定。9GB/T21852—XXXXc）Hansch-Leo法Hansch-Leo法采用公式（B.3）進行計算：lgPow=Σiaifi+bjFj(B.3)式中：fi——碎片常數；Fj——修正項（因子）；aibj——相應的發(fā)生的頻率。原子和基團的碎片值、校正限值Fj的表由試驗和實驗值Pow的誤差推導而來，校正項劃分為不同類型(1)、(4)，開發(fā)的軟件包考已慮到所有結果和修正項(3)。d）聯合方法對于復雜分子lgPow的計算已有了改進，如果將分子分成較大的亞結構，而這些亞結構的lgPow值是可獲得的（如從已有的測定數據那么，碎片（如雜環(huán)、蒽醌、偶氮苯）可用Hansch-π法、Rekker法或Leo法的碎片常數來獲取。B.4注意事項a）當計算需要校正因子時，計算方法僅對部分或全部離子化學物質適用；b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