浙江大學生物工程學復習提綱

1.名詞解釋(1)基因組(genome)ThesumofallthegenesandintergenicDNAonallthedifferentchromosomesofacellisreferredtoasthecellulargenome.(2)DNA測序法Sanger(dideoxy)method:以DNA單鏈作為模板，加入DNA聚合酶和四種dNTP，分別加入少量的ddNTP，在聚合酶的作用下，ddNTP隨機摻入復制鏈中，由于ddNTP的3’端沒有羥基，加入后終止聚合反應，形成不同長度的DNA片段。將這些寡核苷酸片段進行電泳分析(能區(qū)分長度僅差一個核苷酸)，并用35S放射自顯影，讀出DNA上的核苷酸序列。(3)RFLP（p123ofGeneVI）RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)限制性片段長度多態(tài)性（限制性片段指“限制性內(nèi)切酶酶切片段”）即同種不同個體的基因組在用同一種限制性內(nèi)切酶作用時，限制性酶切圖不同的現(xiàn)象。〔限制性酶切圖與基因功能無關，它的多態(tài)性也不一定導致表現(xiàn)型的改變，可以作為geneticmarker〕(4)SNP（Singlenucleotidepolymorphisms）SNP指基因組水平上由單核苷酸改變引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%，是遺傳變異的關鍵指標。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500到1000個堿基對就有一個SNP發(fā)生，估計總數(shù)可達300萬個，甚至更多。SNP既能在編碼區(qū)又能在非編碼區(qū)中發(fā)生?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)的SNP（codingSNP）較少，但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義。由于特殊基因上的SNP很可能對疾病易感性、對于環(huán)境因子和藥物的反應有所作用，所以引起了許多科學家和制藥公司重視。在我國強伯勤主持的中華民族基因組SNP研究計劃也于今年啟動。另外，人類基因組計劃旨在解讀人類分布在24條染色體上的30億對堿基。面對如此龐大信息量，人類基因組測序的策略是以作圖為基礎，將染色體分為易操作的結構區(qū)域。第三代分子標記就是SNP，這使得遺傳圖譜的制作日益精密。（第一代是限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP），第二代是短串聯(lián)重復序列（STR））(5)遺傳圖（p122ofGeneVI）染色體上可變部位的線性排列，由基因重組實驗推斷出來(6)物理圖AmapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA.(如限制性酶切位點)，以bp為單位。(7)葉盤法葉盤法是常用的植物轉(zhuǎn)基因方法，它是新切的對部片與農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天，使└秩局參鏘赴僮遼稈∨溲仙稈∽說南胞（先殺死農(nóng)桿菌，再加入抗生素殺死未轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌質(zhì)粒的植物細胞）。將存活的植物細胞培養(yǎng)形成愈傷組織后,轉(zhuǎn)入合適的配養(yǎng)基中培養(yǎng)為含Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化基因的植株。(8)Ti質(zhì)粒（p443）即腫瘤誘導質(zhì)粒，1971年由Schell在農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)，能使植物產(chǎn)生冠癭瘤。Ti質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，約200－250kb。四個重要區(qū)域為：復制起始點OriV、致病區(qū)(Virregion)、T-DNA區(qū)和農(nóng)桿堿分解代謝區(qū)。Vir區(qū)轉(zhuǎn)錄單位對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化細胞至關重要，但是此區(qū)只有受到植物細胞釋放的信號分子（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮）刺激才能表達。T-DNA（transferDNA）是Ti質(zhì)粒上能被整合到植物核DNA上的片段，。含有Ocs、Roi、Shi等基因。T-DNA兩端各有一個25bp長的高度保守的正向重復序列，其中右邊界序列對于T-DNA的轉(zhuǎn)移至關重要。只要兩端序列存在且方向正確，那么，在兩端序列中間插入任何一個DNA片段都可能被轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中去。這也是我們用Ti質(zhì)粒進行遺傳轉(zhuǎn)化的理論基礎。(9)功能基因組（functionalgenomics）結構基因組學是基因組分析的早期階段，以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主。功能基因組學是利用結構基因組學提供的信息，系統(tǒng)的研究基因功能。他以高通量、大規(guī)模的實驗方法及統(tǒng)計與計算機分析為特征。(10)重組植物利用植物基因工程的手段，在離體條件下按照人們的目的對植物的DNA進行操作，培育新的植株，達到改良植物性狀的目的，這樣獲得的植物即轉(zhuǎn)基因植物。(11)蛋白質(zhì)組（proteome）此概念是澳大利亞學者Wasinger等于1994年提出的，指的是由基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。從這個定義看蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目應該等于基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)（準確的說是ORF的數(shù)目），但在生物體內(nèi)這樣的蛋白質(zhì)組是不存在的。從基因表達的角度說蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目總少于基因組中開放閱讀框的數(shù)目；但是從蛋白質(zhì)修飾的角度說蛋白質(zhì)數(shù)目又遠多于基因組中開放閱讀框的數(shù)目。基因組基本上固定不變，而蛋白質(zhì)組是動態(tài)的，具有時空性和可調(diào)節(jié)性，能反映基因的表達時間、表達量、蛋白質(zhì)的翻譯后加工和亞細胞分布。(12)YAC載體(yeastartificialchromosome)（p639fig20.13ofGeneVI）YAC含有在酵母中增殖一個染色體所必需的序列元素，一個復制起點，一個確保分離進入子細胞的著絲點和封閉染色體末端的端粒。YAC還帶有三個選擇標記(selectablemarker)：TRP1、URA3和SUP4(中間含有SmaI克隆位點)。在載入外源DNA前YAC保持環(huán)狀狀態(tài)。端粒序列后是BamH1酶切位點，用BamH1切割產(chǎn)生線性分子，末端是與完整的染色體相似的保證了線性分子穩(wěn)定的端粒。用SmaI酶切產(chǎn)生平齊末端，DNA可以在此插入。因此兩個酶切同時進行就得到了兩個線性片段(two“arms”)，每一個在一端含有端粒，另一端有可以連接的平末端。每個臂有一個選擇標記，可以用來選出兩個臂都被連接的分子。SUP4標記的喪失使得再連接的YAC與未打開的YAC得以區(qū)分。一個YAC載體可以攜帶大量的DNA，插入300kb并不稀罕。與質(zhì)粒相比，這幾乎提高了一個數(shù)量級。(13)功能篩選（functionscreening）(14)染色體步行(chromosomewalking)（p637fig20.12ofGeneVI）我們從一個已經(jīng)分離的基因克隆開始，這個克隆含有一個已知基因，或者從遺傳圖上知道它在某個我們感興趣的區(qū)域附近。為了使大片段便于操作，我們用來自前一個克隆一端的亞片段，來分離下一個片段。具體方法：我們從原始克隆亞克隆出相應片段(subcloning:把DNA片段從某一載體上克隆到另一載體上)。然后從文庫中辨認出與這個克隆重疊的其他嵌合載體。這些載體將在攜帶第一個克隆片段的一端延伸。我們可以通過制作每個片段的限制性圖來確定延伸方向，這張用新的材料延伸的圖應該含有與第一個克隆一端相同的片段。不斷重復這一過程。原則上，可能步行上百kb，并且基因組中超過1000kb的區(qū)域也曾用這種方法作圖。(15)定位克?。╬ositionalcloning）TheidentificationofagenebasedsolelyonitspositionintheGenome.經(jīng)典定位克〈粹依賴連鎖分析進行染色體定位。定位候?克隆(positionalcandidatecloning)是它的發(fā)展與改進。在克隆遺傳病優(yōu)點：不需要知道基因產(chǎn)物的功能；基因的生化、生理學、病理學、生物學特均非必需。不足：不能顯示基因產(chǎn)物的功能；對于基因功能的認識依賴于與已知功能基因產(chǎn)物的序列同源性；基因組計劃不斷減少這一事件的可能性。(16)轉(zhuǎn)座子：(transponson)存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位，最簡單的轉(zhuǎn)座子不含任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertionsequence,IS），它是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導自身移動的蛋白。IS兩末端為倒置重復序列，轉(zhuǎn)座時往往復制宿主靶位點一段DNA，形成位于IS序列兩端的正向重復區(qū)。(17)轉(zhuǎn)座子示蹤(transponsontagging)又稱轉(zhuǎn)座子標簽，原理：利用轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基礎，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。根據(jù)目的不同，可以采取定向標簽(directedtagging)隨機標簽(randomtagging)兩種標簽策略。這一方法的優(yōu)點是：可以在不了解基因產(chǎn)物大的生化性質(zhì)和表達模式的情況下分離克隆植物基因。2.思考題1）簡述植物對人類的重要貢獻答：a.光合作用：利用光能CO2＋H2O制造O2和有機物，能量的“固定”b.食物來源c.環(huán)境保護：保持水土、防止風沙；d.重要的實驗材料e.藥物與保健品2）簡述制作轉(zhuǎn)基因植物的步驟答：A.目標基因的克隆。Strategies：a.如果有產(chǎn)物的：若為protein則測部分氨基酸序列，合成探針篩選cDNA文庫；若為DNA，則切成片段，接入表達載體表達，進行抗體篩選和功能篩選；或者在cDNA大規(guī)模分析的基礎上進行同源收縮，找出可能的目標基因。b.無產(chǎn)物的可以采用轉(zhuǎn)座子示蹤、Ti質(zhì)粒插入法、定位克隆、cDNA差式顯示等方法克隆其基因。B.植物表達載體的構建在基因的5’端加上啟動子（如35S啟動子），3’端加上終止子。C.植物的遺傳轉(zhuǎn)化主要方法有：a.Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；b.以PEG介導的原生質(zhì)體化學轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；c.電激法；d.用基因槍轉(zhuǎn)入愈傷組織后培養(yǎng)；e.顯微注射(micro-injection);f.病毒感染。D.轉(zhuǎn)化植物細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物鑒定引起表現(xiàn)型變化的可以通過觀察表現(xiàn)型改變而找出成功轉(zhuǎn)入的植株；可以通過報告基因或篩選標記基因來判斷；也可以在DNA、RNA、protein三個水平上鑒定轉(zhuǎn)入基因及其表達情況(Southern/Northern/Westernblotting)來確認。3）簡述用Ti質(zhì)粒（農(nóng)桿菌）轉(zhuǎn)化外源基因的分子機制答：用Ti質(zhì)粒進行遺傳轉(zhuǎn)化的理論基礎是：在T-DNA兩端正向重復序列中間插入任何一個DNA片段都可能被轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中去。另外，去掉T-DNA上的致瘤因子，造成T-DNA大段缺失，或在T-DNA上插入外源基因并不影響T-DNA的轉(zhuǎn)移整合功能。并且由于Vir區(qū)對于T-DNA的轉(zhuǎn)移是通過反式作用因子來實現(xiàn)，所以Vir區(qū)與T-DNA區(qū)可以分別位于兩個復制子上。基于以上性質(zhì)，發(fā)展出了兩個主要的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)，即共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。共整合載體系統(tǒng)(cointergratevector)，Ti質(zhì)粒上編碼致癌基因及冠癭瘤堿基序列常為一段pBR322DNA所代替，當外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌進入農(nóng)桿菌細胞后，兩者相同的pBR322序列間發(fā)生同源同組，導致外源基因整合到Ti質(zhì)粒上。雙元載體包含兩個質(zhì)粒，它們都能在農(nóng)桿菌中復制，其中一個Ti質(zhì)粒(不含T-DNA，且左邊區(qū)與右邊區(qū)被修飾)提供Vir功能，另一個廣宿主范圍的質(zhì)粒攜帶目的基因和植物選擇性標記基因及移動和復制功能基因這兩種系統(tǒng)的中間載體由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到壤農(nóng)桿菌中都需要第三種菌參與，也稱三親交配(triparentalmating).Ti質(zhì)粒的遺傳轉(zhuǎn)化：植物受傷后，傷口細胞分泌大量的酚類化合物(如乙酰丁香酮)，它們是農(nóng)桿菌識別敏感植物的信號分子。農(nóng)桿菌立即趨向這些細胞，最終導致T-DNA的轉(zhuǎn)移。跟據(jù)這一性質(zhì)建立了葉盤法轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。4)全基因組鳥槍法測序的主要步驟5）SNP解析的目的和意義答：a.SNP繼RFLP、STR后稱為第三代基因組作圖的多態(tài)性標記，使得遺傳圖譜的制作更精細，并且適合自動化大規(guī)模掃描。b.由于SNP被認為是一種能夠穩(wěn)定遺傳的早期突變，他們之間存在著連鎖不平衡，與疾病存在著穩(wěn)定的相關性，所以SNP是研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關基因的一種新工具。c.存在于編碼區(qū)以及其緊鄰上下游序列中的SNP，可以改變基因的表達水平和表達產(chǎn)物的功能。d.特殊基因上的SNP可能直接關系到人類對于疾病的易感性和對于環(huán)境因子和藥物的反應性。因此SNP可能將為根據(jù)個體的多態(tài)性開展藥物設計和對特殊群體制訂服藥劑量提供依據(jù)。6)如何提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，提高熱穩(wěn)定性的必要性和可能性答：(1)可能性：噬熱菌(如有些遠古細菌可以耐受100度以上的環(huán)境)以及其它生活在高溫環(huán)境下的生物體內(nèi)的酶熱穩(wěn)定。(2)必要性：酶在各種變性劑下的穩(wěn)定性是阻礙酶的廣泛使用的最大問題之一，而當一個酶熱穩(wěn)定時，它通常很可能對于其它使其三級結構去折疊的因素也穩(wěn)定。另外，在高溫下工作，有許多優(yōu)點：a.每升高10度，反應速度加倍；b.溫度超過60度時抑制了微生物的生長；c.在許多條件下，溫度升高使底物溶解度升高，溶液粘度下降；d.對于吸熱反應提高溫度使平衡向產(chǎn)物方向移動。科研、生產(chǎn)中十分需要能在較高溫度下發(fā)揮作用的酶，如加酶洗衣粉。(3)方法：化學修飾、酶的固定化、蛋白質(zhì)工程、添加劑①利用自然界熱穩(wěn)定的酶尋找自然界中同源的熱穩(wěn)定的酶，一般在生活在60度以上的嗜熱微生物中。幾乎所用的嗜熱菌可以在菌種收藏中心DSM得到。如果在某種生物中酶的量適合，則用它發(fā)酵。否則克隆它的基因，插入載體轉(zhuǎn)入微生物中。如：DNA聚合酶、糖代謝酶嗜熱菌中與嗜溫菌中酶的比較一些氨基酸發(fā)生了代換：Gly->Ala、Ser->Ala、Lys->Arg等產(chǎn)生了以下影響a.堆積緊密(表面積與體積比小穩(wěn)定性高)b.靜電相互作用增加(形成更多離子對如Lys->Arg)c.增加二硫橋、增加疏水相互作用d.增加氫鍵e.微環(huán)境(滲透壓、鈣離子)f.糖基化(多聚糖保持包圍蛋白質(zhì)的水化層、與表面的親水氨基酸形成氫鍵、碳水化合物與臨近肽的立體相互作用穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的構象、使變性或部分變性的狀態(tài)更易溶阻止聚集、遮掩酶切位點，減少蛋白酶水解所必須的構象變化)③蛋白質(zhì)工程：只有一些氨基酸的替換對于熱穩(wěn)定性的提高是必要的。蛋白質(zhì)工程方法：隨機突變、sitedirectedmutagenesis。a.randommutagenesis：制備所有可能的單位點隨機突變文庫，篩選熱穩(wěn)定性提高的幾個突變株，為定點突變提供信息；或者采用evolutionarymolecularengineering方法：編碼目標蛋白的基因轉(zhuǎn)入極端嗜熱菌中，在必需酶才能存活的條件下培養(yǎng)，提高溫度選擇能生存的菌，測序分析突變點。后兩步可以重復以逐漸升溫接近要求溫度。b.sitedirectedmutagenesis：oligonucleotidesdirectedmutagenesis;overlapextensionPCR④化學修飾：是使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的重要和有效的方法之一必需避開活性部位關鍵基團；交聯(lián)的原理是通過在兩部分間橋連，增加結構的剛性，但往往降低活性；⑤酶的固定化：減少亞基分離，解聚⑥添加劑：a.個別情況下底物或底物類似物能夠穩(wěn)定酶，如NAD依賴性脫氫酶：b.表面自由能改變了蛋白質(zhì)溶液相互作用：有機分子、鹽、氨基酸鹽等c.低分子量溶質(zhì)：sugar是好的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，甘油有些特殊。d.聚合物溶質(zhì)如PEG對invertase的穩(wěn)定作用(4)如何作出選擇：a.收集關于蛋白的盡可能多的信息，決定最佳的目標和我們可以采用的方法b.有時簡單的添加劑比我們進行全面的定位突變更有效的達到要求c.方法是否合適依賴于方程：interest＝剩余活力×壽命，必需考慮穩(wěn)定化過程的價格與酶的價格的比例。d.固定化酶在工業(yè)上的應用，優(yōu)勢是不需要了解太多的酶的結構信息，不足是酶要相對高純；隨機突變介于固定化和定位突變之間，我們只需知道cDNA信息，最終篩選出好的廉價的酶源，但并不總能成功；定位突變可以產(chǎn)生要求的氨基酸改變，可以對酶結構的穩(wěn)定及相互作用有深入的了解；酶配方(添加劑)是一個重要參數(shù)；化學修飾提供了一個有效的方法，但是無法提前預知。7)如何得到一個菌種答：獲得菌種的途徑：(1)從ATCC、CGMCC等菌種收藏中心購買(2)從自然環(huán)境中篩選(3)遺傳工程:將目標基因插入人工質(zhì)粒中，篩選好的菌種(4)突變:通過化學、物理或者生物的方法(5)細胞生物學技術：原生質(zhì)體融合在保持滲透壓平衡的條件下除去細胞壁(提高了遺傳重組率)，在融合劑(如PEG)的存在下，原生質(zhì)體融合形成雜合體或雙倍體，融合原生質(zhì)體細胞的再生。主要不足是不穩(wěn)定。8)為什么要進行搖瓶實驗，可得到什么結果答：進行搖瓶實驗的目的是優(yōu)化細胞生長和產(chǎn)物生產(chǎn)的條件，為進一步放大，直至工業(yè)化提供依據(jù)。主要條件有：a.PH值；b.溫度；c.溶氧；d.底物選擇：最大和最優(yōu)底物濃度e.其他條件：如限氮、限磷對于發(fā)酵結果的影響等等9)如果你是一個抗生素工程師，如何設計生產(chǎn)過程答：a.分離或者從菌種收藏中心獲得待選菌種b.篩選有抗菌活性的菌種c.開發(fā)浸沒培養(yǎng)生產(chǎn)方法d.開發(fā)分離純化抗生素的方法e.確定抗生素的性質(zhì)：物理性質(zhì)，如吸附(adsorption)與吸收(absorption);化學性質(zhì)，如反應性，溶劑中的溶解度，對于酸、堿、熱的穩(wěn)定性f.抗生素評估g.藥理實驗h.抗菌活性i.與已有抗生素性能的比較j.開發(fā)實驗工廠規(guī)模(pilotplant)的生產(chǎn)方法k.申請臨床實驗的許可l.實驗提純的抗生素m.開發(fā)工廠車間規(guī)模(plantscale)的生產(chǎn)方法n.獲得面向臨床應用的生產(chǎn)許可o.其它各種各樣的考慮p.開發(fā)抗生素生產(chǎn)控制方法q.新應用的開發(fā)r.Developmentofmarketinganddistributionsystems.Financingofbusiness10)什么是固定化酶，固定化的方法，舉例通過吸附、包埋、交聯(lián)、化學偶聯(lián)等固定化技術將水溶性的酶固定在水不溶性的載體上得到水不溶性的酶，稱為固定化酶。優(yōu)點是：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復使用；穩(wěn)定性好；可連續(xù)生產(chǎn)。缺點是：固定化過程中往往會引起酶的失活。常用固定化技術有：微型膠囊、吸附、膠格包埋、雙功能試劑共價交聯(lián)、化學偶聯(lián)。A.微型膠囊法：酶被包埋在1-100μm的膠囊中，底物與產(chǎn)物可以自由過膜。a.相分離法(酸纖維素：β-D-半乳糖苷酶、天０訪福換棉膠：脲酶)。b.界面聚合法：尼龍66。c.液膜法：聚脲。d.液體干燥法.B.吸附法：物理吸附（靜止法，電沉積法，反應器表面直接沉積法，蕩浴或混合浴沉積法），離子吸附（DEAE－cellulose，DEAE－sephadexA－50）C.膠格包埋法：N，N‘－甲叉雙丙稀酰胺，丙稀酰胺D.雙功能試劑交聯(lián)法：戊二醛E.不溶性載體共價耦聯(lián)法11)藍細菌generecombination常規(guī)步驟：答：a.PCR擴增目標基因片斷b.基因的分子克?。簩⒛繕嘶蚩寺〉絧UC系列的含lacZ基因的質(zhì)粒中，在X-gal平板上，通過檢查因α互補消失產(chǎn)生的白色菌落就可以帶有重組質(zhì)粒的藍細菌c.DNA體外重組構建新的質(zhì)粒：genedeletion和geneinterruption質(zhì)粒的構建d.用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對細胞，篩選突變體質(zhì)粒：e.突變體DNA的PCR檢測和Southernblot分析12)吳慶余構建的基因缺失突變體FRXC還能作什么工作afrxc-突變體在黑暗條件長期培養(yǎng)，藍細菌PCC6803由自養(yǎng)向異養(yǎng)轉(zhuǎn)變(利用Glucose)。這一過程必然涉及一系列基因的開啟表達。為克隆相關的基因提供了可能。b葉綠素與葉綠素結合蛋白相互作用及與對內(nèi)囊體膜形成的調(diào)控：研究表明葉綠素的消失可以導致類囊體膜的消失，而frxc-突變體在黑暗條件不合成葉綠素，在光照條件下可以合成葉綠素的性質(zhì)為我們研究內(nèi)囊體、光合系統(tǒng)組裝的動態(tài)性質(zhì)、以及葉綠素與葉綠素結合蛋白相互作用提供了很好的系統(tǒng)。cfrxc-突變體在黑暗條件長期培養(yǎng)，藍藻的葉綠素含量很低，這可能給藍藻的熱模擬降解產(chǎn)物帶來差異。由于其它大分子的合成未受影響，與正常藍藻比較就可以發(fā)現(xiàn)藍藻熱模擬降解產(chǎn)物中那些組份來源于葉綠素。這可能給出對于重要的標志物分子的前體母質(zhì)來源信息。d紅藻與藍藻藻膽體中含有一類捕光色素復合蛋白－藻膽蛋白。frxc-突變體在黑暗條件合成葉綠素受阻，可能對藻膽蛋白的代謝產(chǎn)生影響。并且類囊體膜的解體也使得藻膽體的定位與裝配發(fā)生改變。efrxc-突變抑制了將原葉綠素酸酯轉(zhuǎn)化為葉綠素的原葉綠素酸酯還原酶活性，必然造成上游的原葉綠素酸酯的積累，以及其它上游物質(zhì)的積累，通過光控開關，研究葉綠素代謝途徑。f.用cDNA差式顯示或基因芯片技術對于有光條件下以及暗條件下，正常以及frxc-突變體基因表達譜進行分析，通過比較找出受frxc調(diào)控的基因（即位于frxc下游的基因），并且分析frxc是否參與了光途徑下葉綠素的合成。13)利用已獲得蛋白克隆其基因答：首先根據(jù)研究工作的目的和性狀的生理生化特性，分離純化所需蛋白質(zhì)和多肽，并對它進行部分氨基酸序列分析或制備單克隆抗體。PCR擴增。根據(jù)所得的氨基酸序列推出可能的核苷酸序列，人工合成兩個簡并的核苷酸引物，以染色體DNA或第一鏈cDNA為模板進行擴增，從而得到目的基因片段。構建cDNA文庫。對于組織中含量豐富的基因：根據(jù)基因表達部位或特異性選取一定的組織提取總RNA，制備poly（A）RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成第一鏈cDNA，并以此為模板，在DNA聚合酶的作用下合成第二鏈cDNA。然后選擇合適的載體構建cDNA文庫。根據(jù)所推測的核苷酸序列合成探針，進行菌落或菌斑原位雜交，篩選重組克隆，并進行序列測定。構建基因組文庫。用內(nèi)切酶將高相對分子量的染色體DNA部分消化，并選擇合適的載體(如噬菌體或cosmid載體建立基因組文庫)，然后用人工合成的寡聚核苷酸或以其cDNA克隆等同源性片段為探針篩選目的基因克隆，也可以利用所制備的抗體通過放射性篩選分離目的基因克隆。14)什么叫生物芯片，其最大特點生物芯片指能對生物分子進行快速并行處理和分析的指甲蓋大小的薄型固體器件。（實際上也可以作化學分子分析）與電子芯片比：在材料、制作工藝、輸出信號、使復雜的系統(tǒng)變小方面相同；但是前者輸入的是液體生物材料，一次性使用；后者可永久使用，輸入為電信號。15)生化實驗的常規(guī)步驟，將三個步驟集成起來有什么好處常規(guī)步驟：樣品制備（collection、storage、classification）、生物化學反應、結果檢測。優(yōu)點：提高分析速度、降低樣品和試劑的消耗量、使實驗室微型化、提高了檢測精度、實驗結果的數(shù)字化便于應用網(wǎng)絡(16)如何開展PHA大規(guī)模生產(chǎn)答：創(chuàng)業(yè)之路：(1)市場調(diào)查與預測、文獻調(diào)研：分析開發(fā)產(chǎn)品的前景、評估從實驗室工作轉(zhuǎn)化為工業(yè)大生產(chǎn)的周期、以及市場競爭力，以決定工作方向。(2)成本評估，項目的規(guī)劃：總投資綱要（固定資本、直接成本(土地、建筑物、保障等)、簡介成本(工程、建筑、意外、酬金)、啟動資金、營運資金）(3)尋找合作伙伴：技術、資金、人力、硬件支持。(4)組織攻關團隊，設計研究技劃：實驗室工作－>工業(yè)化(5)實驗室工作：①菌種篩選②搖瓶實驗(優(yōu)化細胞生長和產(chǎn)物生產(chǎn)的條件，主要條件有：aPH值；b.溫度；c.溶氧；d.底物選擇：最大和最優(yōu)底物濃度e.其他條件：如限氮、限磷對于發(fā)酵結果的影響等等。為進一步放大，直至工業(yè)化提供依據(jù)。)③實驗室規(guī)模的發(fā)酵(5-10L發(fā)酵罐)：發(fā)酵流程的選取Batch（一批）process；Fed-batchprocess；Continuouspr