【組培專(zhuān)題8】組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題解答

【組培專(zhuān)題8】組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題解答1、兩次培養(yǎng)基用的配方都一樣，為什么一個(gè)凝固的特好，一個(gè)就凝固不了？培養(yǎng)基的凝固與否有下列幾種情況決定：1、瓊脂批次有變，沒(méi)有做批次試驗(yàn)，沿用以前的用量造成不足。2、大量元素重復(fù)加入，或大量元素母液配制時(shí)出錯(cuò)。3、pH值調(diào)的過(guò)低，或有活性炭高壓滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成蔗糖分解量劇增，影響培養(yǎng)基的pH值降低較多。4、加入新的天然附加物，或附加物過(guò)多。?2、75%的酒精和70%的酒精有什么區(qū)別，組培時(shí)用哪種好?酒精的70%和75%都是可以的，但往往由于桶裝酒精的濃度達(dá)不到95%，這樣按照70%的配制就達(dá)不到要求了，因此我們一般是桶裝按照75%的配，瓶裝則按照70%的配。?3、大型滅菌器在滅菌的時(shí)候總會(huì)出現(xiàn)個(gè)別瓶子破裂的現(xiàn)象，請(qǐng)問(wèn)什么原因？是溫度過(guò)高，壓力過(guò)大，還是內(nèi)部冷熱不均造成的呢？高壓滅菌造成玻璃瓶的破裂，特別是大型滅菌裝置，最主要還是在放氣冷卻時(shí)造成的。究其原因，應(yīng)該是在放氣時(shí)，由于容積較大，壓力在不同位置（內(nèi)外部）的變化速度并不相同，致使瓶?jī)?nèi)與瓶外的壓力差距較大，如果是封口膜，表現(xiàn)的可能就是塑料膜的破裂。?4、初代培養(yǎng)時(shí)，外植體出現(xiàn)發(fā)白，慢慢枯死，是什么原因？外植體的初代培養(yǎng)出現(xiàn)這種情況，是比較好理解的。大田植物材料離體以后，進(jìn)入不同環(huán)境中繼續(xù)生存代謝，需要一個(gè)過(guò)渡。首先，植物材料要吸收培養(yǎng)基的養(yǎng)分，不再是根吸收，鹽類(lèi)濃度相對(duì)于離體的植物材料的吸收能力可能是過(guò)量的，植物材料褪色就是葉綠素形成受阻和細(xì)胞代謝受阻，另外培養(yǎng)基養(yǎng)分供應(yīng)的有效性滯后，以及植物材料本身內(nèi)含物向培養(yǎng)基的流失等等。建議在初代培養(yǎng)階段最好先采用空白培養(yǎng)。?5、做無(wú)毒苗的快繁，一直找不到合適的培養(yǎng)基，能不能推薦一種？關(guān)于組培快繁的方式概括起來(lái)有下列兩種途徑：1、外植體－愈傷組織－再生芽－繼代－生根－出苗2、外植體－叢生芽－繼代－生根－出苗至于采取那種途徑，需要徹底了解所選組培植物的生物習(xí)性，包括繁殖方式，頂端優(yōu)勢(shì)，萌孽生根能力等。?6、一般情況下KT的母液應(yīng)該配成多大濃度？IAA能高壓滅菌嗎？高壓滅菌成分會(huì)變嗎？KT一般配成0.05－0.1ppm。IAA極不耐高壓滅菌，一般采用過(guò)濾滅菌。如果利用高壓滅菌其分解率會(huì)在85%以上，致使其作用不明顯。?7、植物病毒檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法？由于經(jīng)過(guò)脫毒處理，即使未完成脫除病毒的植株，其體內(nèi)病毒的含量也會(huì)較低，常常在最初的一、二次病毒檢測(cè)中呈陰性，因此有人建議在前18個(gè)月內(nèi)，必須對(duì)植株進(jìn)行若干次檢測(cè)。目前常用的植物病毒檢測(cè)方法有可見(jiàn)癥狀鑒定、寄生鑒別、抗血清檢測(cè)、電鏡檢測(cè)、分子檢測(cè)等?？梢?jiàn)癥狀鑒定法較簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性差，對(duì)于不表現(xiàn)可見(jiàn)癥狀的隱癥病毒幾乎無(wú)效；而電鏡檢測(cè)、分子檢測(cè)雖然檢測(cè)準(zhǔn)確率高，但設(shè)備昂貴，尤其電鏡不可能每個(gè)組培室都配備，故未在生產(chǎn)上廣泛運(yùn)用；目前生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)外仍主要采用鑒別寄主的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)植物病毒。?8、組培苗生長(zhǎng)環(huán)境有何特點(diǎn)？如何針對(duì)這些特點(diǎn)提高移栽成活率？組培苗煉苗是組培過(guò)程中較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，是一個(gè)較為復(fù)雜的技術(shù)體系，提高煉苗成活率是決定組培成敗和降低組培成本的關(guān)鍵。試管苗一般在高濕（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒溫（25℃）下培養(yǎng)，生長(zhǎng)的植株有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）、葉片無(wú)保護(hù)組織（角質(zhì)層、蠟質(zhì)、表皮毛等），加之細(xì)胞間隙大，氣孔開(kāi)張大，因此水分散失較快，易于萎蔫。(2)、根無(wú)根毛或極少，并且有些從愈傷組織上發(fā)育的根與芽的疏導(dǎo)組織不相同，因此吸水能力較弱。而當(dāng)煉苗移栽時(shí)，環(huán)境有了極大的改變：濕度降低、光照增強(qiáng)、溫度升高、溫差變大。具有以上特點(diǎn)的組培苗，在此環(huán)境下，葉片失水較嚴(yán)重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸騰水量，從而造成植物萎蔫，煉苗失敗。另一種情況是，空氣溫度上升要比基質(zhì)溫度上升快，而根系的吸水能力在一定范圍內(nèi)與溫度是成正比的，當(dāng)氣溫升高時(shí)，加之濕度較低，葉片蒸騰急速增加，此時(shí)基質(zhì)溫度上不去，根系吸水能力不夠，造成蒸騰大于吸水的失衡狀態(tài)，從而萎蔫死亡。要想獲得高的煉苗成活率就得針對(duì)以上問(wèn)題，一方面提高出瓶苗的質(zhì)量，提高其抗逆性，生根前的壯苗、理想的生根配方和生根培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控是關(guān)鍵；另一方面就得有針對(duì)組培苗特點(diǎn)創(chuàng)造一個(gè)適宜的煉苗環(huán)境，比如保證空氣濕度，平衡空氣和基質(zhì)的溫度平衡關(guān)系等。?9、有些植物在組培生根階段會(huì)把大量元素和糖減半，根據(jù)什么來(lái)判斷是否需要減半？在組培過(guò)程中，我們提起配方往往只局限于激素的配比和添加物的使用，其實(shí)對(duì)基本培養(yǎng)基的構(gòu)成和培養(yǎng)條件（溫度、光照、濕度、PH等）都屬于配方的范疇。在這方面的調(diào)整主要是根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)狀況靈活調(diào)整。在生根階段，試驗(yàn)證明培養(yǎng)基高滲透勢(shì)或液體培養(yǎng)基有利于營(yíng)養(yǎng)素和激素的運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于根的發(fā)生和形成，因此大部分植物在生根過(guò)程需要調(diào)整基本培養(yǎng)基的組成。但具體需不需要應(yīng)該通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)確定。?10、什么是濾紙橋生根？濾紙橋生根技術(shù)是分化苗直接瓶外生根技術(shù)，其作用主要是簡(jiǎn)化生根環(huán)節(jié)，提高煉苗成活率，降低組培成本，同時(shí)還可以對(duì)污染苗進(jìn)行最大程度的利用。?11、人工種芽的形成標(biāo)志是什么，怎樣才能算是一個(gè)完整的人工種芽？一個(gè)完整的人工種子是由體細(xì)胞胚、人工胚乳和人工種皮三部分組成。它的優(yōu)勢(shì)在于：1、培養(yǎng)條件可以人為控制，省地省工，可直接播種。2、人工種子制作時(shí)，可加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲(chóng)劑等。3、以用于生產(chǎn)人工種子的體細(xì)胞胚，可以利用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，效率極高。4、一些珍貴種苗或樹(shù)種可以通過(guò)人工種子，加速其生產(chǎn)應(yīng)用。存在問(wèn)題：1、并非所有植物都能培育出大量高質(zhì)量的體細(xì)胞胚。2、目前的人工胚乳和種皮還不夠理想，不能有效防止微生物的腐蝕。3、人工種子的貯藏問(wèn)題有待于進(jìn)一步完善。?12、在組培中胚狀體在外部形態(tài)上是如何與愈傷組織區(qū)別的？大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，植物體細(xì)胞具有成胚的潛力，由體細(xì)胞形成的胚狀體叫體細(xì)胞胚。一般情況，體細(xì)胞組織形成愈傷組織之后3周內(nèi)，在愈傷組織上出現(xiàn)大量胚，這些胚是由愈傷組織外層細(xì)胞以及深部細(xì)胞起源的。在離體或活體條件下，體細(xì)胞經(jīng)原胚期、球形胚期、心形胚期、魚(yú)雷胚期和子葉期等階段形成的胚叫體細(xì)胞胚狀體。從外植體或愈傷組織表面產(chǎn)生胚狀體的情況較為常見(jiàn)。從愈傷組織向球形胚過(guò)渡的標(biāo)志是細(xì)胞的活躍分裂形成一團(tuán)致密的沒(méi)有表皮層的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，可以明顯地與疏松的愈傷組織區(qū)分開(kāi)。鑒別胚狀體的標(biāo)準(zhǔn)：1、胚狀體具有極性，也就是說(shuō)胚狀體在發(fā)育的早期階段，在其相反的兩端分化，分別出現(xiàn)莖端和根端，是一種單極性結(jié)構(gòu)。2、在組織學(xué)上，胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的維管組織一般沒(méi)有聯(lián)系，其維管組織的分布呈“Y”字形。而根或芽的分化，里面長(zhǎng)出原形成層束，與愈傷組織形成的或外植體中的維管組織往往相連。?13、如果在配制母液時(shí)，將大量元素和微量元素參在同一個(gè)罐子內(nèi)，會(huì)對(duì)植物有影響嗎？母液配制，主要是考慮到母液穩(wěn)定性問(wèn)題，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)原理，濃度很高的大量元素中的陰離子，對(duì)微量元素的金屬離子來(lái)說(shuō)是過(guò)量的，因此若混在一起，微量元素中的金屬離子會(huì)很容易發(fā)生水解反應(yīng)，生成沉淀，從而失效。長(zhǎng)時(shí)間使用這樣的母液，就會(huì)發(fā)生生理病害，比如缺素癥（黃葉，葉不展，萎縮變脆等）。建議使用干粉式培養(yǎng)基。?14、植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為什么只用蔗糖而不用葡萄糖？為什么動(dòng)物培養(yǎng)的培養(yǎng)液中用葡萄糖而不用蔗糖？這個(gè)問(wèn)題應(yīng)該從植物與動(dòng)物的生理機(jī)制去思考。植物與動(dòng)物的最大差別就是植物是自養(yǎng)型的（光合作用），而動(dòng)物是異養(yǎng)型的（外部吸收代謝）。植物光合產(chǎn)物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），貯藏產(chǎn)物形式是淀粉，而淀粉的合成前體就是蔗糖。蔗糖＝葡萄糖＋果糖，所以蔗糖的合成必須同時(shí)要有葡萄糖和果糖，其實(shí)植物也只能吸收葡萄糖和果糖。在組織培養(yǎng)中加入蔗糖，經(jīng)熬煮和高壓滅菌后就會(huì)分解成植物能夠吸收的葡萄糖和果糖形式。其實(shí)這樣看來(lái)在組培中，植物也有部分異養(yǎng)的特點(diǎn)，如果在培養(yǎng)基中缺少任何一種糖的形式，植物在自養(yǎng)能力（光合，呼吸，產(chǎn)物代謝等）較差的情況下，就難免會(huì)影響其生理代謝。與植物不同的，動(dòng)物是異養(yǎng)型的他不需要淀粉的積累，也沒(méi)光合作用，動(dòng)物細(xì)胞本身所處的生理環(huán)境和代謝方式就決定了它對(duì)糖形式的要求了。?15、在初代培養(yǎng)階段，成功地誘導(dǎo)出綠色的愈傷組織；進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)愈傷組織增殖很快，卻始終沒(méi)有出芽，如何解決不產(chǎn)生不定芽的問(wèn)題？愈傷組織誘導(dǎo)成功后，如何有效地誘導(dǎo)出不定芽是相當(dāng)重要的。外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間和愈傷生長(zhǎng)的程度，隨不同植物種類(lèi)和培養(yǎng)條件有較大的差異。有些植物形成不定芽比較容易，能夠直接從外植體受傷的或沒(méi)有受傷的部位分化出不定芽。一般認(rèn)為細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值是控制器官發(fā)生的重要因素，調(diào)整他們的適當(dāng)比值就可以有效的控制愈傷組織的芽、根等器官的分化。在此理論下，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的能力，與愈傷組織的狀態(tài)密切相關(guān)，能夠誘導(dǎo)形成分生細(xì)胞團(tuán)至關(guān)重要，分生細(xì)胞排列較為規(guī)律，較大的在外，越向內(nèi)細(xì)胞越小，排列也越緊密，細(xì)胞質(zhì)濃厚，核相對(duì)較大，這樣的分生細(xì)胞在激素比值調(diào)控的情況下，就很容易形成不定芽。這也就是為什么愈傷組織在繼代的時(shí)候要交替使用不同激素的原因。?16、NAA和2，4-D哪個(gè)生長(zhǎng)素促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)效果更好？對(duì)于愈傷誘導(dǎo)和增殖來(lái)說(shuō)，2，4－D效果要比NAA明顯；但有一個(gè)問(wèn)題，很多情況下，2，4－D誘導(dǎo)的愈傷比較難以再生芽。?17、在組培中，葉片較易脫落，是什么原因引起的呢？葉片脫落是對(duì)逆境的一種表現(xiàn)，溫度過(guò)高、透氣不良、培養(yǎng)物過(guò)于密集、久不轉(zhuǎn)移、有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會(huì)引起植物材料的落葉或黃化。?18、空白培養(yǎng)是什么意思？空白培養(yǎng)在高效外植體系的建立方面是很有用的步驟?？瞻着囵B(yǎng)就是不加任何激素的培養(yǎng)過(guò)程。對(duì)于外植體迅速適應(yīng)瓶?jī)?nèi)環(huán)境和有效外植體群體的建立是很有用的。?19、如果芽體只是長(zhǎng)高，不膨大也不分化，有的靜止不動(dòng)，請(qǐng)問(wèn)這會(huì)是什么原因引起的呢成活外植體如何成功啟動(dòng)是組培過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)之一。由于大田植物材料其激素水平和細(xì)胞活性差距較大，如何迅速將外植體對(duì)培養(yǎng)基條件做出反應(yīng)也有很多方法，首先芽體萌發(fā)時(shí)應(yīng)用赤霉素，黑暗培養(yǎng)，高低激素配合使用等都會(huì)起到很好的效果。?20、用幼芽啟動(dòng)用于分化芽的愈傷，NAA與6-BA的比例有一般規(guī)律嗎？還有用2，4-D啟動(dòng)的愈傷再轉(zhuǎn)到只含NAA和6-BA的培養(yǎng)基中，愈傷變?yōu)榫G色，有分化的可能嗎？離體的愈傷組織是一種正在增生的非組織化的細(xì)胞群，可以從幾乎任何類(lèi)型的植株獲得。由外植體形成愈傷組織很少是自發(fā)的，它代表創(chuàng)傷反應(yīng)的擴(kuò)展，一般要求在培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)素，常常還要求有細(xì)胞分裂素同時(shí)存在。最有效地產(chǎn)生愈傷組織的激素濃度隨所用的植物及器官而異，但其比外植體直接誘導(dǎo)苗所需的濃度要高。大多數(shù)植物中愈傷組織可從外植體上分離開(kāi)，并可進(jìn)行繼代培養(yǎng)和連續(xù)繁殖，所使用的培養(yǎng)基中所含的激素水平，與用于誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)相同。如果降低激素水平，或適當(dāng)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂素的比例，某些愈傷組織將再生出苗或胚。?21、在壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)有黃葉出現(xiàn)，葉子都枯了。是什么原因引起的組培苗的黃化是由培養(yǎng)基成分、環(huán)境、激素、碳水化合物等各種因素引起的，但這樣的解釋是比較抽象的。我覺(jué)得在壯苗生根階段，由于培養(yǎng)基的變化，特別是激素的改變導(dǎo)致培養(yǎng)基高壓滅菌后PH變化與分化階段是有較大差別的，加之苗子與培養(yǎng)基接觸面積的變小，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)滯后。所以當(dāng)根長(zhǎng)出來(lái)以后，會(huì)有不同程度的改變。如果解決的話(huà)，還應(yīng)該確定一下生根培養(yǎng)基高壓滅菌后的pH變化，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，同時(shí)在分化時(shí)進(jìn)行適當(dāng)壯苗調(diào)整也是比較好的方法。?22、使用玻璃瓶和不銹鋼的蓋子作為培養(yǎng)容器，透氣性是不是不好，會(huì)影響培養(yǎng)效果嗎？培養(yǎng)容器的透氣性是決定瓶?jī)?nèi)濕度和氣體狀況的主要因素，因此如果過(guò)于密封，使瓶?jī)?nèi)外得不到氣體交換，就會(huì)不同程度的受到影響。建議使用透氣性好的培養(yǎng)容器。?23、生化培養(yǎng)箱可以進(jìn)行植物組織培養(yǎng)嗎？它與光照培養(yǎng)箱有什么不同？光照培養(yǎng)箱主要是模擬植物的光照條件，更適合植物的培養(yǎng)、種子發(fā)芽等的實(shí)驗(yàn)，而生化培養(yǎng)箱更偏重于溫度、濕度的控制，微生物實(shí)驗(yàn)等比較合適。?24、水解酪蛋白有酸水解，有酶水解，在使用過(guò)程中有沒(méi)有區(qū)別，他們的在培養(yǎng)基中的作用是一樣的嗎？水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在500mg/L，特別是當(dāng)有高水平IAA存在時(shí)更是如此。對(duì)于酪蛋白不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，但考慮到組培苗的異養(yǎng)功能，酸解應(yīng)該更有利于發(fā)揮其作用。?25、有些樹(shù)種受傷后會(huì)分泌出一些白色的漿液，比如梓葉槭，不管是莖段還是葉片，只要有傷口的地方都會(huì)有漿液，而這會(huì)加重外植體的褐化，請(qǐng)問(wèn)應(yīng)該怎么處理呢？這是植