DB32T 2957-2016 鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測(cè)方法

備案號(hào)：51404-2016DB32PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳輝、袁銳、方蘋、倪金俤、劉訓(xùn)猛、陳靜、郭立新、1鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測(cè)方法凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試SC/T7014-2008水生動(dòng)物產(chǎn)地3.5MgCl2（25mmol/L生化試劑，-20℃保存。2GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸4儀器和設(shè)備有臨床癥狀的魚，如體長(zhǎng)不超過4cm，取鰓；體長(zhǎng)為4cm~636.1.2加入600μL酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）至樣品離心管中，持續(xù)上下顛倒用力混合至少1min，12000r/min4℃離心10min，小心取上層水相（約700μL）置于新的1.5mL離心管中。），6.1.4加入-20℃預(yù)冷的1.5倍體積無(wú)水乙醇（約900μL倒轉(zhuǎn)數(shù)次混勻后，置-20℃沉淀1h以上。6.1.512000r/min4℃離心30min，小心去上清，倒置于吸DNA抽提也可選用商品化病毒DNA抽提試劑盒，按相應(yīng)說(shuō)明書提供的方法予以抽提。50μL體系10×PCR緩沖液（無(wú)Mg2+）51×MgCl2（25mmol/L）5dNTP(10mmol/L)12100pmol/μL引物F111pmol/μL100pmol/μL引物R111pmol/μL滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.025U/μL待檢DNA模板或?qū)φ?46.3.2將平板放入水平電泳槽，電泳緩沖液剛好淹6.3.3加樣：10μL樣品加入2μL樣品緩沖液，混勻后加入樣品孔。6.3.5紫外燈下觀察核酸帶，并7.2當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢5試劑及其配制A.1CTAB溶液A.2酚—三氯甲烷—異戊醇A.3三氯甲烷—異戊醇A.4TBE電泳緩沖液（5×濃縮液）A.56×DNA上樣緩沖液61CCCAGCAACATGTGCGACGGAGGCATCAG61TTCTGTCTCGAGTATGTCAGAAACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGA121AGTAACATGGAAGAGATCAAGGAATACCCGCACA181TACAAGAACCGAGAGGTCGGTTGGACTCGGTTTG241CACTACCTCTCTATGAGATCTCAGTACAAGAAACGCATCAAGACCGA301CTCAAGGCGTACTATGATCAGATGCAGGGTGAGATGAAAGTATGCGC361GGCGTGAGCCAGAGTCTCTGTCAGCATCTGACTACTTGGT421CTGGTCGAGAACGCTGTAAAACACACTCCGGGTATGACC7