T LC生物自顯影篩選天然產(chǎn)物菊花等中的抗氧化成分

TLC生物自顯影篩選天然產(chǎn)物菊花等1TLC（thinlayerchromatography）薄層色譜，又稱薄層層析、薄板層析、薄板色譜。TLC為其簡(jiǎn)稱薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固—液吸附色譜。薄層色譜(ThinLayerChromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固－液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，薄層色譜法還可用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10×3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。薄層色譜法（TLC系將適（Rf）與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對(duì)比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，使在移動(dòng)相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分的互相分離的目的。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。吸附是表面的一個(gè)重要性質(zhì)。任何兩個(gè)相都可以形成表面，吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象。物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留，這是因?yàn)楣腆w表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對(duì)稱的，其力場(chǎng)互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對(duì)稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體表面時(shí)受到這種剩余力的影響，就會(huì)被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過程。例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同，使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng)時(shí)，帶著樣品中的各組分一起移動(dòng)，同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對(duì)它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點(diǎn)。如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據(jù)這些已知化合物的Rf值（后面介紹Rf值）對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定，同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某些方法加以定量。Rf=溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離。表示物質(zhì)移動(dòng)的相對(duì)距離。比移值各種物質(zhì)的Rf隨要分離化合物的結(jié)構(gòu)，濾紙或薄層板的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對(duì)每一種化合物來說是一個(gè)特定數(shù)值。儀器與材料1載版用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板，對(duì)薄層板的要求是：需要有一定的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)惰性，且厚度均勻、表面平整，因此玻璃板是最常用的。載板可以有不同規(guī)格，但最大不得超過20×20，玻璃板在使用前必須洗凈、干燥備用。玻板除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。(2)固定相（吸附劑）或載體〈[254]〉，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F〈[254]〉等。其顆粒大小，一般要求直徑為10～40μm。薄層涂布，一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系將固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140□烘4小時(shí))，混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5～0.7％)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。3涂布器應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層(4)點(diǎn)樣器定性：內(nèi)徑為0.5mm管口平整的普通毛細(xì)管。定量：微量注射劑。(5)展開室應(yīng)使用適合載板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密的蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于觀察。操作薄層板制備除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.2～0.3mm取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干，后在110□烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。手工制板一般分不含粘合劑的軟板和含粘合劑的硬板倆種。常用吸附劑的基本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分離效果不好，太細(xì)溶液流速太慢。一般說來吸附性強(qiáng)的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁一般在100-150目。氧化鋁分為堿性氧化鋁，適用于碳?xì)浠衔铩⑸飰A及堿性化合物的分離，一般適用于PH為9-10的環(huán)境。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁適用于PH4~4.5的酸性有機(jī)酸類的分離。氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個(gè)級(jí)，一級(jí)活性最高，五級(jí)最低。黏合劑及添加劑：為了使固定相（吸附劑）牢固地附著在載板上以增加薄層的機(jī)械強(qiáng)度，有利于操作，需要時(shí)在吸附劑中加入合適的黏合劑：有時(shí)為了特殊的分離或檢出需要，要在固定相中加入某些添加劑。薄層板的活化：硅膠板于105-11℃烘30分鐘，氧化鋁板于150-160℃烘4小時(shí)，可得活性的薄層板。點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑及點(diǎn)間距離同紙色譜法,點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。點(diǎn)樣直徑不超過5mm，點(diǎn)樣距離一般為1~1.5cm即可。樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將呈空心環(huán)——環(huán)形色譜效應(yīng)。因此配制樣品溶液時(shí)應(yīng)選擇對(duì)組分溶解度相對(duì)較小的溶劑。點(diǎn)樣方式有點(diǎn)狀點(diǎn)樣和帶狀點(diǎn)樣。展開薄層展開展開劑也稱溶劑系統(tǒng)，流動(dòng)性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動(dòng)相的液體。展開劑的主要任務(wù)是溶解被分離的物質(zhì)，在吸附劑薄層上轉(zhuǎn)移被分離物質(zhì)，使個(gè)組分的Rf值在0.2~0.8之間并對(duì)被分離物質(zhì)要有適當(dāng)?shù)倪x擇性。作為展開劑的溶劑應(yīng)滿足以下要求：適當(dāng)?shù)募兌?、適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、低黏度、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓一級(jí)盡可能低的毒性。展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環(huán)形及向心3種幾何形式。A單次展開用同一種展開劑一個(gè)方向展開一次，這種方式在平面色譜中應(yīng)用最為廣泛。（垂直上行展開，垂直下行展開，一向水平展開，對(duì)向水平展開）B多次展開單向?qū)Υ苏归_，用相同的展開劑沿同一方向進(jìn)行相同距離的重復(fù)展開，直至分離滿意，廣泛應(yīng)用于薄層色譜法C雙向展開用于成分較多、性質(zhì)比較接近的難分離組分的分離。薄層展開展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點(diǎn)浸入展開劑中密封室蓋，待展開至規(guī)定距離(一般為10～15cm)，取出薄層板，晾干，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定檢測(cè)。影響展開的因素制備離心色譜儀A相對(duì)濕度的影響B(tài)溶劑蒸汽的影響（a展開室的飽和b預(yù)吸附）C溫度的影響D展距的影響與分離度僅正比與展距的平方根。顯色A光學(xué)檢出法a自然光（400~800nm）b紫外光（254nm或365nm）c熒光一些化合物吸收了較短波長(zhǎng)的光，在瞬間發(fā)射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的熒光斑點(diǎn)（靈敏度高、專屬性高）B蒸汽顯色法顯色多數(shù)有機(jī)化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點(diǎn)，這種反應(yīng)有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點(diǎn)逐漸消退，并且不會(huì)改變化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時(shí)常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強(qiáng)了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強(qiáng)烈而穩(wěn)定的熒光，對(duì)定性及定量都非常有利，但是制備薄層時(shí)要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質(zhì)。C物理顯色法用紫外照射分離后的紙或薄層后，使化合物產(chǎn)生光加成，光分解、光氧化還原及光異構(gòu)等光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如形成熒光發(fā)射功能團(tuán)。發(fā)生熒光增強(qiáng)或淬滅及熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)等現(xiàn)象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。D試劑顯色法廣泛應(yīng)用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑一般都適用于薄層色譜，還有防腐劑的顯色劑不適合用于紙色譜及含有有機(jī)黏合劑薄層的顯色，又時(shí)噴顯色劑后續(xù)加熱，這也不是用于紙色譜。顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。b浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設(shè)定浸板及抽出速度和規(guī)定在顯色劑中浸漬的時(shí)間。顯色試劑a通用顯色劑硫酸溶液（硫酸：水1：1，硫酸：乙醇1：1）、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、堿性高錳酸鉀溶液（還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點(diǎn)）b專屬顯色劑(5)測(cè)定比移值在一定的色譜條件下，特定化合物的Rf值是一個(gè)常數(shù)，因此有可能根據(jù)化合物的Rf值鑒定化合物。(6)薄層掃描薄層掃描法指用一定波長(zhǎng)的光照射在經(jīng)薄層層析后的層析板上，對(duì)具有吸收或能產(chǎn)生熒光的層析斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，用反射法或透射法測(cè)定吸收的強(qiáng)度，以檢測(cè)層析譜。對(duì)于中成藥復(fù)方制劑，亦可用相應(yīng)的原藥材按需要組合作陰、陽對(duì)照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。使用儀器為薄層掃描儀。如需用薄層掃描儀對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描檢出，或直接在薄層上對(duì)色譜斑點(diǎn)作掃描定量，則可用薄層掃描法。薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長(zhǎng)或單波長(zhǎng)掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點(diǎn)在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對(duì)照品在同一塊薄層上展開后掃描，進(jìn)行比較并計(jì)算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。應(yīng)用食品和營(yíng)養(yǎng)食品中的營(yíng)養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、油和脂肪、維生素、食用色素等。與食品和營(yíng)養(yǎng)有害的物質(zhì)則有殘留農(nóng)藥、致癌的曲黃霉素等。這些成分都可用薄層色譜法定性和定量。蛋白質(zhì)和多肽水解為氨基酸，對(duì)不同來源的動(dòng)物性和植物性蛋白水解后產(chǎn)生不同的氨基酸進(jìn)行定性和定量，有助于解決蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和食品營(yíng)養(yǎng)問題。二十多種氨基酸用硅膠G薄層板雙向展開，一次即能分開，然后定性和定量，方法快速而簡(jiǎn)便。多糖和寡糖可水解為單糖，可用薄層色譜法進(jìn)行單糖和雙糖的定性和定量。文獻(xiàn)上有每一個(gè)糖的Rf值和相應(yīng)的展開劑。油和脂肪解為脂肪酸，脂肪酸的種類和結(jié)構(gòu)中的不飽和鍵數(shù)，與營(yíng)養(yǎng)和衛(wèi)生有關(guān)，關(guān)于油和脂肪的薄層（硅膠、硅藻土、纖維素)分析，文獻(xiàn)和綜述很多。脂溶性和水溶性維生素在薄層上可方便地定性和定量，例如脂溶性維生素A，D，E，K及B2，B6，B12，酶酸，泛酸，葉酸，C，促生硅膠G薄層上可用苯：甲醇：丙酮：冰醋酸（7:2:0.5:0.5）分開。用硅膠G薄層和丙酮：氯仿（1:1）以及激發(fā)波長(zhǎng)365nm和波長(zhǎng)450nm，可用熒光法測(cè)定ng量的曲黃素B1,B2,G1,G2,法靈敏快速。藥物和藥物代謝薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的應(yīng)用很廣。有些文獻(xiàn)和內(nèi)容偏重于合成藥物、化合物及其代謝產(chǎn)物，有文獻(xiàn)為在中草藥分析中的應(yīng)用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯駢噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物堿、強(qiáng)心甙、黃酮、揮發(fā)油和萜等，都包括幾種或十幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非