組織保護(hù)劑對(duì)病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA的保存效果探究

艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸生物技術(shù)進(jìn)展生物技術(shù)進(jìn)展2024年第14卷第1期60~65CurrentBiotechnologyISSN2095?2341SpecialForumonDevelopmentand艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸組織保護(hù)劑對(duì)病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA的保存效果探究李華1，徐蘭舉1，黃學(xué)亮2，王亞如3，刁立琴3*，于月欣1*1.河北納科生物科技有限公司，石家莊050035；2.河北以嶺醫(yī)院，石家莊050090；3.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊050227摘要：病毒核酸和生物組織樣本RNA容易受到外部環(huán)境的影響，極易發(fā)生降解，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重偏差。以病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA為研究對(duì)象，探究組織保護(hù)劑保存它們?cè)诓煌瑴囟确胖貌煌瑫r(shí)間后，對(duì)病毒載量以及豚鼠皮膚組織樣本中RNA的保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4℃保存30d，25℃保存7d或37℃保存24h后，與初始病毒核酸量相比儲(chǔ)存組相比較，組織保護(hù)劑組與市售RNAlater組均可以保持豚鼠皮膚組織中樣本RNA的提取量和純度，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，組織保護(hù)劑定時(shí)間，不影響病毒核酸的病毒載量以及豚鼠皮膚組織樣本RNA的提取量和純度，使樣本保存更簡(jiǎn)便高效。GuineaPigSkinTissueSamplesLIHua1，XULanju1，HUANGXueliang2，WANGYaru3，DIAOLiqin3*，YUYuexin1*基金項(xiàng)目：河北省引進(jìn)國(guó)外智力項(xiàng)目。聯(lián)系方式：李華E-mail163.com*通信作者：刁立琴E-mail:768624340@；于月欣E-mail:359274691@李華，等：組織保護(hù)劑對(duì)病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA的保存效果探究61在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與檢測(cè)過(guò)程中，生物樣本的保存對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性至關(guān)重要。儲(chǔ)存后的生物材料應(yīng)在分析前具有最小的變化，以便為研究人員提供高質(zhì)量的樣品，從而得出可靠以及可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)結(jié)果［1］。冷凍組織是目前現(xiàn)代生物學(xué)檢測(cè)中最常用的生物樣本，樣本的冷凍儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中通常會(huì)選擇液氮作為儲(chǔ)存劑［2］。液氮的低溫特性是樣本保存的理想條件，但其可能會(huì)導(dǎo)致接觸者的活組織產(chǎn)生快速凍結(jié)現(xiàn)象。快速凍結(jié)現(xiàn)象被稱為“低溫?zé)齻?，?huì)造成參與樣品存儲(chǔ)和檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)重凍傷［3］。除液氮外，干冰也是進(jìn)行生物樣品低溫運(yùn)輸?shù)某Ｓ梅绞?。但干冰同樣存在易凍傷的危險(xiǎn)，且其易升華，放置在普通密閉容器內(nèi)有爆炸的危險(xiǎn)。當(dāng)大量使用干冰時(shí)，要保持環(huán)境的通風(fēng)，防止大量氣體揮發(fā)造成人員窒息。液氮和干冰的危險(xiǎn)性質(zhì)以及高昂的運(yùn)輸成本極大地限制了其常規(guī)使用［4］。此外，冷凍樣品往往會(huì)導(dǎo)致生物樣本細(xì)胞內(nèi)外的冷凍損傷和滲透應(yīng)激［5］。因此，探究易于實(shí)施、成本低廉且更安全的樣品儲(chǔ)存運(yùn)輸方式對(duì)生物樣品的結(jié)果檢測(cè)至關(guān)重要。很多臨床手術(shù)樣本很難及時(shí)凍存到液氮或者干冰，甚至-80℃冰箱中，因此RNA樣本的采集、運(yùn)輸、保存及使用困難。RNAlater是由Ambion公司研發(fā)的組織保護(hù)劑產(chǎn)品。RNA保護(hù)劑的問(wèn)世解決了臨床組織樣品中RNA極易降解的難題。本文研發(fā)了一種新配方的組織保護(hù)劑，探究了其對(duì)病毒核酸載量的保護(hù)效果，比較了其與市售RNAlater產(chǎn)品以及常規(guī)儲(chǔ)存方式對(duì)豚鼠皮膚組織樣本RNA提取量和純度的影響，旨在為實(shí)驗(yàn)生物樣品RNA的保存與運(yùn)輸提供一種安全簡(jiǎn)便的選擇。1材料與方法購(gòu)自青島康大愛(ài)博生物科技有限公司。許可證號(hào)：1.2主要試劑與儀器組織保護(hù)劑屬于本公司自研產(chǎn)品，其組成成分如下：在去離子水中，充分溶解40%硫酸銨、5%氯化鈉、1mg·L-1RNase抑制劑混合液、0.1%DEPC水。待所有試劑充分溶解后，使用有機(jī)酸（HCl與H2SO4等量混合調(diào)節(jié)溶液pH至賽默飛公司，91226297）、RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP419）、DEPC水（北京索萊red（美國(guó)USEVERBRIGHTINC公司，IS0429）、瓊loadingbuffer（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，D0071）、50×TAE緩沖溶液（北京索萊寶科技有限實(shí)驗(yàn)涉及儀器：NanoDrop×2000c分光光度計(jì)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）、瓊脂糖電泳儀（美國(guó)Bio-rad1.3.1核酸病毒的病毒載量檢測(cè)本研究收集了20例新型冠狀病毒感染患者的核酸病毒，將其放入組織保護(hù)劑中。核酸病毒管在4℃、室溫（25℃)和37℃放置不同時(shí)間后，送河北以嶺醫(yī)院檢驗(yàn)科PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。與初始核酸病毒載量相比較，核酸病毒放置不同時(shí)間后病毒載量的改變情況。本研究共設(shè)置以下分組：4℃條件下，24h組。1.3.2皮膚組織樣本RNA提取量、純度和降解情況檢測(cè)本研究取豚鼠皮膚組織樣本，放入液氮組、市售RNAlater液組和組織保護(hù)劑組中。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的組織樣本在4℃放置30d、25℃放或37℃放置24h后，稱量20mg豚鼠皮膚組織樣本，檢測(cè)不同保存方式在保存相同時(shí)間后組織樣本RNA的降解情況。使用組織研磨器在液氮中研磨組織塊，然后按照RNA提取試劑盒的步驟提取組織細(xì)胞RNA。提取RNA后，進(jìn)行RNA提取62生物技術(shù)進(jìn)展CurrentBiotechnology62量和純度的檢測(cè)。本研究進(jìn)一步利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA降解情況的檢測(cè)，各組取2.5μLRNA與泳，觀察RNA條帶的情況。1.3.3統(tǒng)計(jì)方法本研究中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果與分析2.1核酸病毒載量的檢測(cè)合適的樣本保存液能夠保證病毒的檢出率，避免發(fā)生漏檢［6］。在4℃條件下，20份新型冠狀組病毒核酸的提取，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)病毒載量的變化，結(jié)果如表1所示，20份病毒樣本的循Ct值均在初始Ct值附近波動(dòng)，各處理Ct值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05證實(shí)本組織保護(hù)劑在4℃條件下可以保存病毒30d，對(duì)病毒核酸具有較好的保護(hù)效果。下，組織保護(hù)劑可以保存病毒7d。的變化情況。與0h組相比較，各實(shí)驗(yàn)組的Ct值的條件下，組織保護(hù)劑對(duì)病毒載量的保存效果可以長(zhǎng)達(dá)24h。表14℃放置不同時(shí)間后病毒核酸載量的比較組別21d30dt P 表225℃放置不同時(shí)間后病毒核酸載量的比較組別t P 表337℃放置不同時(shí)間對(duì)病毒核酸載量的比較組別24ht P 2.2皮膚組織樣本的RNA檢測(cè)RNA很容易被RNA酶降解，因此需要一種高效、無(wú)害的方法來(lái)優(yōu)化RNA的保存和提?。?］。RNA的濃度和純度是進(jìn)行RNA樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)李華，等：組織保護(hù)劑對(duì)病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA的保存效果探究63的主要標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)行后續(xù)研究的必要前提［8］。本研究取豚鼠的皮膚組織，放入液氮、市售RNAlater和組織保護(hù)劑中，市售RNAlater和組織保護(hù)劑組在4℃放置30d后，取20mg組織提取RNA，比較各組組織RNA的提取量和純度。如圖1A所示，組織保護(hù)劑保存樣本的RNA提取量與液氮保存或市售RNAlater保存無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異RNA條帶均存在28S和18S條帶，且28S條帶組所提RNA的完整性好（圖1B）。本研究檢測(cè)了各組樣本RNA在A260/A280吸光度值、A260/A230吸光度值的改變。液氮組A260/A280吸光度均值為1.91、A260/A230吸光度均值為2.07；市售RNAlater組的A260/A280吸光度均值為1.93、A260/A230吸光度均值為2.06；組織保護(hù)劑組的A260/A280吸光度均值為1.96、A260/A230吸光度均值為2.07。如圖1C~D所示，各實(shí)驗(yàn)組RNA的A260/A280吸光度值與A260/A230吸光度值之間無(wú)顯著差異A：各組提取的RNA提取總量；B：各組提取總RNA的瓊脂糖凝膠圖譜，M—DNAmaker；C~D：各組提取的RNA純度圖14℃放置30d后不同處理對(duì)RNA保護(hù)的驗(yàn)證結(jié)果圖2為豚鼠皮膚組織樣本在25℃放置7d的結(jié)果。組織保護(hù)劑保存樣本的RNA提取量、A260/A280吸光度值和A260/A230吸光度值與液氮保存組或A：各組提取的RNA提取總量；B：各組提取總RNA的瓊脂糖凝膠圖譜，M—DNAmaker；C~D：各組提取的RNA純度圖225℃放置7d后不同處理對(duì)RNA保護(hù)的驗(yàn)證結(jié)果本研究取豚鼠的皮膚組織在各實(shí)驗(yàn)組中37℃放置24h后，取20mg組織進(jìn)行組織中RNA的提取。如圖3所示，與液氮保存組或市售RNAlater組相比較，組織保護(hù)劑保存樣本的RNA在提結(jié)果表明，本公司自研生產(chǎn)的組織保護(hù)劑與進(jìn)口市售RNAlater具有相近的RNA保護(hù)效果，可以作為其替代品應(yīng)用。64生物技術(shù)進(jìn)展CurrentBiotechnology64A：各組提取的RNA提取總量；B：各組提取總RNA的瓊脂糖凝膠圖譜，M—DNAmaker；C~D：各組提取的RNA純度圖337℃放置24h后不同處理對(duì)RNA保護(hù)的驗(yàn)證結(jié)果3討論隨著我國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域的迅速發(fā)展，更多研究者開(kāi)始注重生物資源的利用。此時(shí)，生物樣本的質(zhì)量對(duì)生物科學(xué)領(lǐng)域的研究愈發(fā)重要［9］。在醫(yī)學(xué)研究中，生物樣本是聯(lián)系分子信息與疾病發(fā)現(xiàn)的橋梁［10］。無(wú)論是用于研究還是治療，細(xì)胞和組織低溫保存的整個(gè)過(guò)程都充滿了風(fēng)險(xiǎn)［11］。生物樣本的保存環(huán)境和運(yùn)輸條件會(huì)嚴(yán)重影響樣本質(zhì)量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要［12］。在心臟移植手術(shù)中，心臟保存液是一個(gè)非常重要的因素，其保存效果直接影響著移植心臟的功能狀態(tài)、患者的臨床預(yù)后及遠(yuǎn)期生活質(zhì)量［13］。本研究將核酸病毒樣本以及豚鼠皮膚的組織樣本保存在自研的組織保護(hù)劑中，結(jié)果證實(shí)組織保護(hù)劑對(duì)病毒載量以及皮膚組織樣本RNA具有很好的保護(hù)效果，能夠滿足安全高效運(yùn)輸樣本的要求。病毒樣本的保存和運(yùn)輸條件對(duì)其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要［14］。本研究探究了組織保護(hù)劑對(duì)核酸病毒的保存效果，結(jié)果證實(shí)核酸病毒在4℃條件下放置24h，Ct值均在初始Ct值附近波動(dòng)，證實(shí)組織保護(hù)劑對(duì)病毒載量具有很好的保護(hù)效果，有助于檢測(cè)的高效性和準(zhǔn)確性。隨著分子生物技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用，從生物實(shí)驗(yàn)材料成功提取總RNA是保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的必要前提［15］。豚鼠皮膚組織樣本RNA的以及37℃放置24h后，組織保護(hù)劑保存樣本RNA的提取量、RNA條帶完整性、純度與液氮保存組及市售RNAlater保存組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，組織保護(hù)劑與市售RNAlater均具有對(duì)RNA質(zhì)量和純度的保護(hù)效果。上述結(jié)果表明河北納科生物科技有限公司生產(chǎn)的組織保護(hù)劑對(duì)核酸病毒載量以及豚鼠皮膚組織中的RNA具有良好的保護(hù)效果。在不需液氮的情況下，組織保護(hù)劑對(duì)豚鼠皮膚組織的RNA具有良好的保護(hù)效果，這將降低實(shí)驗(yàn)的研發(fā)成本并保護(hù)研發(fā)人員的安全。此外，本公司組織保護(hù)劑配方中95%原料來(lái)自國(guó)產(chǎn)原料，極大降低了實(shí)驗(yàn)成本。綜上所述，本公司成功開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的組織保護(hù)劑，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的冷凍保存組織樣本，安全有效降低實(shí)驗(yàn)樣本的儲(chǔ)存成本。［1］IMRALIA,HUGHESCS,COETZEEAS,etal..Validationof［3］MEHTAR,BARANOVAA,BIRERDINCA.Do-It-Yourself［6］王豐,葉俊煒,於林芬.病毒保存液相關(guān)性能研究[J].中國(guó)消李華，等：組織保護(hù)劑對(duì)病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA的保存效果探究65WANGF,YEJW,YULF.Studyontheperformanceofvirus［7］DANIELSENPL,KOUDAHLV,CHRISTENSENB,etal..［8］楊秀榮,王慶容,劉惠茹.保存溫度對(duì)黃顙魚(yú)肝組織總RNAYANGXR,WANGQR,LIUHR.Effectofstoragetempera?［10］趙佐舜,劉寶林.低溫保存技術(shù)在生物樣本庫(kù)中的應(yīng)用[J].165-174.［12］趙同香,蔣向明,王海英,等.探討藥物臨床試驗(yàn)生物樣本流通環(huán)節(jié)常見(jiàn)問(wèn)題及風(fēng)險(xiǎn)前置化管理措施[J].中國(guó)食品藥ZHAOTX,JIANGXM,WANGHY,etal..Discussionof［13］李勇男.不同心臟保存液對(duì)供體心臟保護(hù)效果評(píng)價(jià)與供體心臟中冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白作用機(jī)制的研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2019.［14］史春麗