《日化產(chǎn)品除菌效果的評價(jià)方法》

1QB/TXXXX—XXXX日化產(chǎn)品除菌效果的評價(jià)方法本方法描述了具有除菌功能的織物洗滌劑和肌膚清潔產(chǎn)品的除菌效果的評價(jià)方法。本文件第一法適用于織物洗滌劑的除菌效果評價(jià)，第二法適用于肌膚清潔產(chǎn)品的除菌效果評價(jià)。本文件不適用于配方中添加微生物的產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T25812染料試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)漂白棉布QB/T2738—2023日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價(jià)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1除菌eliminatingbacterial采用物理化學(xué)方法洗去載體表面上附著的細(xì)菌/真菌的過程。3.2載體carrier試驗(yàn)微生物的支持物。），3.3菌落形成單位colonyformingunit；CFU在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌落或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落。），3.4織物洗滌劑fabricdetergent用于織物的洗滌產(chǎn)品。3.5肌膚清潔產(chǎn)品skincleansingproducts用于人體肌膚清潔類的產(chǎn)品。2QB/TXXXX－XXXX4生物安全及無菌操作的基本要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)滿足GB19489的相關(guān)規(guī)定，由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行試驗(yàn)。無菌操作的基本要求參考QB/T2738—2023第4章。5第一法織物洗滌劑除菌效果評價(jià)方法5.1原理將試驗(yàn)微生物懸浮液涂覆到載體上，模擬實(shí)際洗滌過程用待測試樣處理染菌載體，再通過無菌操作回收載體表面殘留活菌。同時(shí)用無菌硬水處理染菌載體作為空白對照，用于試驗(yàn)有效性評價(jià)指標(biāo)，并對染菌載體進(jìn)行基線回收，用于評價(jià)待測試樣的除菌效果。5.2儀器與設(shè)備5.2.1高壓蒸汽滅菌鍋。5.2.2恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。5.2.3恒溫磁力攪拌器：配圓柱帶節(jié)型攪拌轉(zhuǎn)子，8mm×35mm。5.2.4分析天平：精度為0.01g、0.001g。5.2.5試管：?18mm×180mm。5.2.6移液器：20μL，1mL，5mL，10mL。5.2.7培養(yǎng)皿：?90mm。5.2.8錐形瓶：500mL。5.2.9廣口玻璃瓶：400mL，瓶口寬60mm~70mm，帶塞子。5.2.10渦旋震蕩器。5.2.11鑷子。5.2.12醫(yī)用無菌采樣杯：60mL。5.2.13濁度儀。5.2.14生物安全柜5.2.15恒溫水浴鍋：控溫精度±1℃5.3試劑5.3.1培養(yǎng)基商品化的合格市售培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）。5.3.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）稱取2.83g磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、1.36g磷酸二氫鉀（KH2PO4），加蒸餾水1000mL，待完全溶解后，調(diào)pH至7.2~7.4，經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.3.3硬水（硬度342mg/L）稱取0.304g氯化鈣（CaCl2）、0.139g氯化鎂（MgCl2?6H2O加蒸餾水1000mL，即為342mg/L硬水。經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.3.4洗脫液稱取3.0g大豆卵磷脂、10.0g吐溫80，加入0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）1000mL，溶解后攪拌均勻，經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。5.4評價(jià)原則5.4.1織物洗滌劑作用濃度與測試菌種的選擇一般情況按產(chǎn)品說明中標(biāo)識(shí)的除菌作用濃度和試驗(yàn)菌種進(jìn)行。如產(chǎn)品說明未標(biāo)識(shí)可參考表1進(jìn)行，也可根據(jù)產(chǎn)品的使用要求增加其他菌種作為檢驗(yàn)菌種。3QB/TXXXX—XXXX表1織物洗滌劑作用濃度與試驗(yàn)菌種的選擇肺炎克雷伯菌（ATCC4352）5.4.2菌落計(jì)數(shù)按GB4789.2中規(guī)定計(jì)數(shù)。5.5操作步驟5.5.1菌懸液的準(zhǔn)備取菌種3代~5代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物，參照QB/T2738—2023中7.2.2.5制備菌懸液，用0.03mol/LPBS溶液將試驗(yàn)菌懸液稀釋，通過濁度儀調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL備用。5.5.2測試載體的前處理以符合GB/T25812規(guī)定的純棉白布作為測試載體，參照QB/T2738—2023中7.4.4.1脫脂處理后裁剪成3cm×3cm的方布片，121℃滅菌20min45±1）℃烘干備用。5.5.3染菌載體的制備每片3cm×3cm布片平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，各接種20μL菌懸液使其均勻擴(kuò)散到布片上，蓋上蓋子于（36±1）℃的培養(yǎng)箱中干燥固定20min，取出放入生物安全柜備用（染菌載體應(yīng)4h內(nèi)使用）。5.5.4基線回收每3片5.5.3制備好的染菌載體為一組，將1組染菌載體逐片放入含30mL洗脫液的醫(yī)用無菌采樣杯中，在渦旋震蕩器上混合60s進(jìn)行基線回收。5.5.5試驗(yàn)組的處理5.5.5.1洗滌試驗(yàn)在400mL廣口玻璃瓶內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)用250mL的硬水將待測洗滌產(chǎn)品稀釋至產(chǎn)品標(biāo)明的除菌作用濃度，或參考表1執(zhí)行。注意洗滌溶液的水溫控制在（30±1）℃,將配制好的洗滌溶液放于磁力攪拌器上混勻至少10min。5.5.5.2將一組5.5.3制備好的染菌載體逐片放入廣口玻璃瓶內(nèi)，蓋上塞子啟動(dòng)磁力攪拌器，300r/min磁力攪拌20min。用無菌鑷子夾出布片并等待至布片無滴水，倒掉廣口玻璃瓶中的洗滌液，將布片放回廣口玻璃瓶內(nèi)，再加入250mL的硬水蓋上塞子，300r/min磁力攪拌漂洗5min，漂洗過程中水溫同樣控制在（30±1）℃,以此方式漂洗2次。洗滌或漂洗過程中如果出現(xiàn)布片粘貼在玻璃瓶內(nèi)壁、轉(zhuǎn)子失控、布片和轉(zhuǎn)子掛在一起等異?，F(xiàn)象可人工干預(yù)使其恢復(fù)正常。5.5.5.3漂洗完畢后用無菌鑷子取出3片染菌載體，等待至布片無滴水，逐片放入含30mL洗脫液的醫(yī)用無菌采樣杯中，旋緊瓶蓋，在渦旋震蕩器上混合60s，然后用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜的稀釋度樣液1.0mL接種于無菌平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。用冷卻至40℃~45℃的TSA培養(yǎng)基15mL～20mL作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，做活菌菌落計(jì)數(shù)（或根據(jù)所選菌種選用合適培養(yǎng)條件）。5.5.6空白對照組的處理以無菌硬水代替試驗(yàn)產(chǎn)品，同時(shí)按上述步驟操作，作為空白對照組。5.5.7試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)重復(fù)3次，取其算術(shù)平均值用于結(jié)果計(jì)算。5.6結(jié)果計(jì)算和評價(jià)4QB/TXXXX－XXXX5.6.1試驗(yàn)結(jié)果有效性評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果有效性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下，當(dāng)條件a)、b)中有任一條不滿足時(shí)試驗(yàn)結(jié)果無效；當(dāng)僅有條件c)不滿足時(shí)報(bào)告測試樣品無除菌效果；當(dāng)同時(shí)滿足以下條件時(shí)，當(dāng)次試驗(yàn)結(jié)果有效可進(jìn)行除菌率的計(jì)算。a)要求基線回收菌落數(shù)在106CFU/組～107CFU/組范圍內(nèi)。b)活菌計(jì)數(shù)誤差評價(jià)符合QB/T2738—2023中7.2.6要求。c)3次測試3組試驗(yàn)組的菌落回收對數(shù)值（lgTs）與3組空白對照組的菌落回收對數(shù)值（lgTo）進(jìn)行比較。要求3次測試均滿足lgTs＜lgTo。5.6.2除菌率計(jì)算除菌率C按式（1）計(jì)算，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示，保留兩位小數(shù)C=×100%……（1）式中：C——測試樣品除菌率；Ⅰ——基線細(xì)菌回收平均菌落數(shù)；Ⅱ——試驗(yàn)組洗滌后回收平均菌落數(shù)。5.6.3除菌效果評價(jià)當(dāng)除菌率≥90%時(shí)，表明此條件下產(chǎn)品有除菌效果。6第二法肌膚清潔產(chǎn)品除菌效果評價(jià)方法6.1原理將試驗(yàn)微生物懸浮液涂覆到載體上，模擬實(shí)際洗手過程用待測試樣處理染菌載體，再通過無菌操作回收載體表面殘留活菌。同時(shí)用無菌硬水處理染菌載體作為空白對照，用于試驗(yàn)有效性評價(jià)指標(biāo)。并對染菌載體進(jìn)行基線回收，用于評價(jià)待測試樣的除菌效果。6.2儀器與設(shè)備6.2.1高壓蒸汽滅菌鍋。6.2.2恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。6.2.3濁度儀。6.2.4分析天平：精度為0.01g。6.2.5試管：?18mm×180m6.2.6移液槍：0.10mL，1mL，5mL，10mL。6.2.7培養(yǎng)皿：?90mm。6.2.8錐形瓶：500mL。6.2.9渦旋震蕩器。6.2.10無菌剪刀，鑷子。6.2.11無菌密封袋。6.2.12涂布棒。6.2.13無塵紙。6.2.14生物安全柜。6.3試劑6.3.1培養(yǎng)基商品化的合格市售培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基（TSB）、改良6.3.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）5QB/TXXXX—XXXX6.3.3硬水（硬度342mg/L）6.4評價(jià)原則6.4.1測試菌種金黃色葡萄球菌（ATCC6538）?？筛鶕?jù)產(chǎn)品的實(shí)際作用，增加測試菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。6.4.2測試載體仿真皮1以蛋白為主要原材料制作，一面光滑另一面粗糙的半透明薄膜，具有一定硬度，搓洗不破。仿真皮可通過紫外照射的方式進(jìn)行滅菌。6.4.3菌落計(jì)數(shù)按GB4789.2中規(guī)定計(jì)數(shù)。6.5操作步驟6.5.1菌懸液的準(zhǔn)備將傳代次數(shù)不超過5代的金黃色葡萄球菌（6.4.1）保藏菌株在合適的培養(yǎng)基如TSA上劃線，經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)18h~24h。從平板上挑取一個(gè)單菌落接種到含30mLTSB的50mL無菌容器中，經(jīng)（36±1）℃靜置培養(yǎng)18h~24h。要求濃度為5.0×108CFU/mL～1.0×109CFU/mL。6.5.2染菌載體的制備使用無菌剪刀將仿真皮（6.4.2）裁成6cm×6cm大小，平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，粗糙面朝上。在每塊仿真皮上接種0.10mL菌懸液，使用一次性涂布棒將菌液涂抹均勻，避免接觸仿真皮邊緣部位，于室溫下靜置30s，備用。6.5.3基線回收每3塊6.5.2制備好的染菌載體為1組，將1組染菌載體分別放入3個(gè)含10mLMLBTL采樣溶液的密封袋內(nèi)均勻搓揉1min進(jìn)行基線回收。6.5.4試驗(yàn)組的處理6.5.4.1調(diào)整水溫為20℃~24℃,且水的流速為2.0L/min～4.0L/min，并保證整個(gè)清洗過程水溫和流速符合上述要求。水的潔凈度達(dá)到≤100CFU/mL的要求。6.5.4.2將染菌載體放置在硬質(zhì)平板上。6.5.4.3對于香皂產(chǎn)品，用潤濕的香皂均勻涂擦染菌載體15s。對于液體類產(chǎn)品，用注射器吸取0.45mL樣品，均勻涂抹至染菌載體表面。6.5.4.4保持各個(gè)部位揉搓的一致性，揉搓染菌載體30s。6.5.4.5保持仿真皮和水流的夾角大約為120°,且出水處距離仿真皮頂端的垂直距離保持在5cm～7cm。依靠水的自然下流沖洗染菌載體30s，沖洗過程中通過左右移動(dòng)平板確保所有部位均被沖洗到。6.5.4.6用無塵紙將沖洗完畢染菌載體上的水蘸干（不應(yīng)搓擦，只需用紙巾輕輕拍打仿真皮即可）。6.5.4.7每個(gè)測試樣品洗滌1組6.5.2制備好的染菌載體。6.5.4.8每塊染菌載體在清洗后的1min內(nèi)，放入含10mLMLBTL采樣溶液的密封袋內(nèi)，均勻搓揉仿真皮1min。然后用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜的稀釋度樣液1.0mL接種于無菌平皿，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。用冷卻至40℃~45℃的TSA培養(yǎng)基15mL～20mL作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，做活菌菌落計(jì)數(shù)。6.5.5空白對照組的處理均以0.45mL無菌硬水代替試驗(yàn)產(chǎn)品，同時(shí)按上述步驟操作，作為空白對照組。6QB/TXXXX－XXXX6.5.6試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)重復(fù)3次，取其算術(shù)平均值用于結(jié)果計(jì)算。6.6結(jié)果計(jì)算和評價(jià)6.6.1試驗(yàn)結(jié)果有效性評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果有效性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下，當(dāng)條件a)、b)中有任一條不滿足時(shí)試驗(yàn)結(jié)果無效；當(dāng)僅有條件c)不滿足時(shí)報(bào)告測試樣品無除菌效果；當(dāng)同時(shí)滿足以下條件時(shí)，當(dāng)次試驗(yàn)結(jié)果有效可進(jìn)行除菌率的計(jì)算。a)要求基線回收菌落數(shù)大于107CFU/組。b)活菌計(jì)數(shù)誤差評價(jià)符合QB/T2738—