第十八章 細(xì)胞衰老與死亡課件

第十八章細(xì)胞衰老與死亡第十八章

細(xì)胞衰老與凋亡第十八章細(xì)胞衰老與死亡細(xì)胞衰老與凋亡衰老是指年齡老化及其器官或細(xì)胞功能的衰退。它是生物的基本特征，是不以人的意志為轉(zhuǎn)移的自然規(guī)律。

時(shí)光流逝歲月不饒人青春永駐長命百歲現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：心理性衰老生理性衰老病理性衰老現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：生理性衰老病理性衰老現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：生理性衰老第十八章細(xì)胞衰老與死亡細(xì)胞衰老與凋亡衰老及其機(jī)制細(xì)胞凋亡機(jī)體和組織器官的衰老衰老的機(jī)制基因的調(diào)控作用細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)細(xì)胞凋亡與疾病第十八章細(xì)胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機(jī)制

概念：正常環(huán)境下發(fā)生的細(xì)胞的生理功能和增殖能力的減弱，以及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并趨向于死亡的現(xiàn)象，又稱老化。后果：機(jī)體衰老、老年病人體的代謝功能是由不同的組織細(xì)胞相互配合共同完成的。這種互補(bǔ)性造成了不同組織細(xì)胞相互依存的現(xiàn)象，某一組織細(xì)胞功能衰退將直接或間接影響到其他組織細(xì)胞功能。因此，對高等動(dòng)物或人體來說，衰老發(fā)生在整體水平。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機(jī)制

細(xì)胞衰老的特征：細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性降低，細(xì)胞膜的通透性改變，物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ芙档汀＃ò装l(fā)）細(xì)胞內(nèi)色素增多，妨礙細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的交流和傳遞。（老年斑）細(xì)胞內(nèi)水分減少，細(xì)胞萎縮，體積變小。（皺紋）一、機(jī)體和組織器官的衰老第十八章細(xì)胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機(jī)制

從細(xì)胞和分子水平闡述衰老的機(jī)制的學(xué)說已達(dá)300余種，目前比較盛行的是

差錯(cuò)/損害學(xué)說、遺傳程序?qū)W說、自由基學(xué)說。二、衰老的機(jī)制第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（一）差錯(cuò)/損害學(xué)說

1963年Orgel提出“差錯(cuò)成災(zāi)”學(xué)說，認(rèn)為在機(jī)體細(xì)胞合成蛋白質(zhì)時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中隨時(shí)可發(fā)生差錯(cuò)，有個(gè)別氨基酸錯(cuò)誤的摻入蛋白質(zhì)（種類、位置），因而產(chǎn)生出差錯(cuò)的蛋白質(zhì)或差錯(cuò)的聚合酶。如果差錯(cuò)出現(xiàn)在酶的活性中心，將引起酶活性或特異性聚合酶功能上的改變，繼而產(chǎn)生有差錯(cuò)的DNA或RNA，在此基礎(chǔ)上又繼續(xù)產(chǎn)生新的差錯(cuò)。如此循環(huán)下去，在差錯(cuò)堆積成災(zāi)時(shí)則使機(jī)體代謝障礙，導(dǎo)致衰老。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制根據(jù)中心法則的推斷，認(rèn)為在DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯中隨時(shí)可能發(fā)生差錯(cuò)，這種差錯(cuò)可以不斷擴(kuò)大，造成細(xì)胞衰老、死亡。如DNA轉(zhuǎn)錄mRNA的過程發(fā)生微小的差異，帶有該微小差異的mRNA會(huì)翻譯出進(jìn)一步偏離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)如果屬于DNA聚合酶會(huì)合成差異程度更大的DNA，這樣的差錯(cuò)經(jīng)過每一次信息傳遞都擴(kuò)大一些，形成惡性循環(huán)，使細(xì)胞內(nèi)積累許多差錯(cuò)分子造成災(zāi)難，細(xì)胞正常功能不能發(fā)揮，致使細(xì)胞衰老、死亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制Smith提出交聯(lián)假說認(rèn)為，機(jī)體中蛋白質(zhì)、核酸等大分子可以通過共價(jià)交叉結(jié)合，形成巨大分子。這些巨大分子難以酶解，堆積在細(xì)胞內(nèi)。隨著增齡，在有害因子自由基的作用下，交聯(lián)反應(yīng)增多，又不能及時(shí)修復(fù)，損害細(xì)胞的正常功能，生物分子的理化性質(zhì)就會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致衰老。這種交聯(lián)反應(yīng)可發(fā)生于細(xì)胞核DNA鏈之間，也可以發(fā)生在DNA與蛋白質(zhì)之間和膠原纖維之間。交聯(lián)學(xué)說在本質(zhì)上并未超出“差錯(cuò)成災(zāi)”學(xué)說的范圍，只不過是對其做了進(jìn)一步的說明和解釋。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明，從Wistar系老年大鼠（18月齡）和年輕大鼠（5月齡）的研究中發(fā)現(xiàn)，取鼠肝提取DNA，測其溶解溫度和增色效應(yīng)，取鼠尾腱分別測定膠原纖維收縮起始溫度、膠原蛋白含量及可溶性膠原含量，發(fā)現(xiàn)大鼠衰老后DNA交聯(lián)損傷增加，膠原纖維交聯(lián)損傷增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對“差錯(cuò)成災(zāi)”的有力支持，但也有很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持此學(xué)說。隨著分析方法的改進(jìn)和分析技術(shù)的提高，目前認(rèn)為衰老細(xì)胞中出現(xiàn)的DNA和蛋白質(zhì)的改變，大部分是隨細(xì)胞衰老出現(xiàn)的變化而不是細(xì)胞衰老的原因。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制線粒體DNA（mtDNA）與衰老和某些老年性疾病關(guān)系的研究，近期發(fā)展較快。研究認(rèn)為，mtDNA突變造成線粒體氧化磷酸化功能障礙，能量產(chǎn)生不足與器官老化和多種老年性疾病有關(guān)。mtDNA是由堿基對構(gòu)成的雙股環(huán)狀DNA，一條為輕鏈，一條為重鏈，均有編碼功能，其編碼的產(chǎn)物涉及氧化磷酸化所需的細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素c，NADH脫氫酶亞單位等。mtDNA因不與組蛋白結(jié)合，所以易受活性氧等自由基侵害，造成氧化損傷，另外由于其內(nèi)不含內(nèi)含子，沒有修復(fù)系統(tǒng)，所以任何形式的突變均可能影響線粒體的功能。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制mtDNA突變有3種類型：點(diǎn)突變、缺失、重復(fù)突變。有人認(rèn)為這3中突變方式都可能導(dǎo)致人和動(dòng)物的衰老和疾病的發(fā)生。大量研究表明，mtDNA缺失突變較為普遍，引起的后果較嚴(yán)重。有資料證明，人心臟和腦細(xì)胞中mtDNA多缺失5.0kb和7.4kb片段，且隨年齡增加明顯增加。35歲以前幾乎檢測不到mtDNA缺失，63~74歲缺失片段比35歲增長14倍，80歲又比63~74歲增高4倍。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制mtDNA突變不僅與衰老有關(guān)，而且會(huì)導(dǎo)致多種老年病。有人認(rèn)為mtDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其容易受到自由基侵害，導(dǎo)致突變，引起細(xì)胞代謝出現(xiàn)異常，mtDNA損傷積累越來越多，正常細(xì)胞呼吸鏈被干擾，與呼吸有關(guān)的酶系統(tǒng)退化，氧化磷酸化作用越來越弱，并出現(xiàn)缺陷，結(jié)果導(dǎo)致神經(jīng)退化性疾病如帕金森病、阿爾海默病，大腦、骨骼肌、腎和內(nèi)分泌腺等退化性疾病的發(fā)生和加劇。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（二）遺傳程序?qū)W說20世紀(jì)60年代，由Hayflick等提出，該學(xué)說的基本觀點(diǎn)認(rèn)為，衰老與發(fā)育、生長和成熟相似，都是由遺傳基因調(diào)控的程序化過程所控制，按照一定的時(shí)間順序所表現(xiàn)出來的生命現(xiàn)象。不同種屬生物有不同的壽命是由各自的遺傳基因所決定的。（機(jī)體壽命與細(xì)胞壽命相關(guān)性）近年來，隨著端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，為這一學(xué)說豐富了內(nèi)容。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制端粒是真核細(xì)胞染色體自然末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，起著固定DNA雙螺旋，防止DNA鏈被解開的作用。人類端粒由位于染色體末端的重復(fù)序列(TTACCG)n及一些結(jié)合蛋白所組成。1986年，Cooke發(fā)現(xiàn)，每次細(xì)胞分裂后，其端粒就縮短一些，直至最后其減少至幾十個(gè)bp。此時(shí)若細(xì)胞進(jìn)一步分裂會(huì)導(dǎo)致染色體的磨損，因而細(xì)胞進(jìn)入黃昏時(shí)期直到最終死亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制研究表明，端粒具有重要的作用，端粒決定了細(xì)胞的壽命，因?yàn)镈NA復(fù)制過程中，與模板3‘端配對的引物降解后，沒有上游引物延長序列填補(bǔ)。所以，DNA每復(fù)制一次，端粒即丟失50~200bp，當(dāng)它縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞則停止分裂，進(jìn)而衰老、死亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制端粒序列的復(fù)制依賴于一種特殊的DNA聚合酶，即稱為端粒酶的核蛋白酶。該酶能夠合成端粒DNA，修復(fù)被損傷了的端粒并使其延長，但機(jī)制仍然不是十分清楚，有待進(jìn)一步研究。在85%~95%的常見腫瘤細(xì)胞中，存在高表達(dá)的端粒酶活性，而在大多數(shù)正常細(xì)胞中，一般測不到端粒酶活性。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制有研究發(fā)現(xiàn)，在未分化的成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞分裂次數(shù)越多，端粒長度越短。隨著細(xì)胞衰老，血液及結(jié)腸粘膜細(xì)胞中端粒平均長度也不斷縮短。胚胎細(xì)胞、永生化細(xì)胞和其他一些表達(dá)端粒酶活性的干細(xì)胞壽命均比無端粒酶活性的細(xì)胞長。因而有人認(rèn)為端粒的縮短是啟動(dòng)衰老的分子鐘，端粒失去DNA這一過程向細(xì)胞發(fā)出信號以停止其分裂，從而決定細(xì)胞有限的生命時(shí)限。細(xì)胞衰老的端粒假說雖然被大多實(shí)驗(yàn)研究證明，但并不是在所有細(xì)胞中都適用，人角膜內(nèi)皮細(xì)胞就不受端粒酶的影響。盡管端粒和端粒酶的研究并不能解釋所有的衰老機(jī)制，但它卻是是衰老-抗衰老研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容，如延長細(xì)胞生命或腫瘤的發(fā)生。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（三）自由基學(xué)說（國際公認(rèn)學(xué)說）1954年Harman提出了衰老的自由基學(xué)說，他認(rèn)為衰老過程中的退行性變化是由于細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。其反應(yīng)能力很強(qiáng)，可使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害細(xì)胞的正常功能。還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，影響其正常功能。生物體的衰老過程是機(jī)體的組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基積累結(jié)果，自由基可以引起DNA損傷從而導(dǎo)致突變，誘發(fā)腫瘤形成。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制自由基及其衍生自由基是指具有未配對電子的原子、原子團(tuán)、離子、基團(tuán)或分子，他們的共同特征是最外層的電子不成對，這有別于過渡性金屬電子層內(nèi)層存在的不成對電子，后者不屬于自由基，沒有強(qiáng)氧化作用。自由基包括羥自由基、氯原子、超氧陰離子、NO分子等，是參與人體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的最重要最廣泛的的反應(yīng)成分。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制活性氧是指從氧衍生出來的自由基及其產(chǎn)物，不僅免疫細(xì)胞能釋放大量活性氧，許多正常細(xì)胞和癌細(xì)胞也同樣能釋放活性氧。產(chǎn)生的主要部位是線粒體的電子傳遞鏈上泛半醌/細(xì)胞色素b區(qū)域產(chǎn)生超氧陰離子自由基與過氧化氫。實(shí)驗(yàn)表明，人的成纖維細(xì)胞在5%~95%氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞壽命縮短；將成纖維細(xì)胞放在含特丁基氫過氧化物的培養(yǎng)基中數(shù)分鐘，可加速細(xì)胞衰老。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制通過對大量研究結(jié)果的深入分析，人們發(fā)現(xiàn)最大壽命與抗氧化力/活性氧生成量呈相關(guān)性。由此看出，提高抗氧化力和降低活性氧生成量都有助于延長壽命，但這并不是充足條件，提高抗氧化力/活性氧生成量的比值才是滿足延長最大壽命的條件。自由基學(xué)說與前兩種學(xué)說有交叉，在差錯(cuò)/損壞學(xué)說中，利用自由基的作用解釋蛋白質(zhì)或核酸交聯(lián)產(chǎn)生的原因以及線粒體損傷的原因；在端粒研究中，稍高氧壓下與正常氧壓下培養(yǎng)細(xì)胞，端?？s短速率增快。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（四）細(xì)胞凋亡學(xué)說細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。衰老是具有累積性、漸進(jìn)性、內(nèi)生性的生命過程。在衰老過程中，機(jī)體各組織器官功能逐漸衰退和喪失，最終死亡。細(xì)胞凋亡是維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，與衰老過程中組織器官功能的退化、衰老相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制差錯(cuò)理論認(rèn)為，導(dǎo)致衰老的誘因來自于外界，差錯(cuò)缺乏修復(fù)或不可修復(fù)，差錯(cuò)累積，造成衰老，認(rèn)為衰老是一種被動(dòng)過程。而程序理論認(rèn)為，衰老是細(xì)胞自發(fā)的，主動(dòng)的過程，由基因程序按照“生物鐘”的安排所決定。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自由基也參與細(xì)胞凋亡。在諸種細(xì)胞凋亡的誘因中，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生活性氧自由基如O2﹣

、OH﹣

、H2O2等被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。羥自由基可引起蛋白質(zhì)氧化、DNA鏈斷裂、細(xì)胞膜發(fā)泡等，這些正是細(xì)胞凋亡的特征。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制維爾納綜合征（Werner’ssyndrome）是一種遺傳性成年早老癥，是編碼一種類似DNA解旋酶的基因發(fā)生突變所致，研究表明其患者Fas基因介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡大大增加。阿爾茨海默病（AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白在腦中的沉積，可增加胞內(nèi)鈣離子濃度，造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡；AD患者腦內(nèi)細(xì)胞丟失可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。氧自由基也參與老年癡呆的病理過程，腦內(nèi)缺乏保護(hù)性抗氧化物質(zhì)，容易受氧自由基攻擊，氧自由基可能通過細(xì)胞凋亡來加重對AD的損傷。第十八章細(xì)胞衰老與死亡成人早衰癥

第十八章細(xì)胞衰老與死亡嬰幼兒早衰癥

第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制不同的細(xì)胞由不同的基因調(diào)控凋亡的發(fā)生。與細(xì)胞分化和衰老有關(guān)基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的有：c-fos、e-jun、c-myc、P53、Rb、Fas等，抑制細(xì)胞凋亡的有：Bcl-2、AdeovirusE3基因等。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（五）體細(xì)胞突變學(xué)說由Failla于1958年提出，該學(xué)說認(rèn)為體細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，結(jié)果使其形態(tài)、功能失調(diào)，引起衰老發(fā)生。形象的說，體細(xì)胞的衰老是由于某種衰老性的“打擊”造成的，如同衰老之箭擊中了細(xì)胞內(nèi)的靶子而導(dǎo)致衰老。此學(xué)說有其局限之處，細(xì)胞突變不一定指向衰老。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（六）免疫功能下降學(xué)說該學(xué)說認(rèn)為，由于免疫系統(tǒng)功能下降或異常導(dǎo)致其他器官、細(xì)胞的功能異常，引起衰老。免疫功能異常確實(shí)與衰老的表現(xiàn)有非常密切的關(guān)系，但是確定免疫系統(tǒng)功能異常與衰老之間的因果關(guān)系，仍需進(jìn)一步深入研究。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（七）內(nèi)分泌功能降低學(xué)說也稱其為神經(jīng)內(nèi)分泌階段式調(diào)節(jié)學(xué)說，是衰老學(xué)說中重要的一種，該學(xué)說認(rèn)為，衰老的內(nèi)分泌系統(tǒng)有一個(gè)中樞在大腦。腦內(nèi)有一組控制身體功能而使其他物質(zhì)不能代替的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，如下丘腦-垂體軸。當(dāng)內(nèi)分泌功能減退時(shí)，機(jī)體的內(nèi)環(huán)境失去平衡，功能發(fā)生紊亂，代謝出現(xiàn)障礙，衰老隨之而來，嚴(yán)重則導(dǎo)致死亡。一些學(xué)者認(rèn)為，衰老不會(huì)僅由下丘腦功能的改變或激素調(diào)節(jié)的障礙所致，而是整個(gè)內(nèi)分泌器官功能性降低（內(nèi)分泌-神經(jīng)控制系統(tǒng)障礙）的結(jié)果。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（八）有害物質(zhì)積蓄學(xué)說該學(xué)說中有害物質(zhì)是指脂褐素，因而也稱脂褐素學(xué)說。細(xì)胞中脂褐素隨年齡增加而增多是一個(gè)顯而易見的事實(shí)。有學(xué)者認(rèn)為脂褐素在細(xì)胞中積蓄，擾亂了細(xì)胞空間，改變了擴(kuò)散渠道，影響了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，引起衰老。第十八章細(xì)胞衰老與死亡(二)衰老的機(jī)制（九）微量元素學(xué)說微量元素學(xué)說是以體內(nèi)必須微量元素含量異常或代謝失調(diào)，非必需的以及有害微量元素過量來解釋衰老的發(fā)生機(jī)制。機(jī)體通過體內(nèi)的自身平衡機(jī)制來保證體內(nèi)微量元素的平衡，保持正常生理狀態(tài)時(shí)，可達(dá)到自然壽限，如果發(fā)生異常則會(huì)導(dǎo)致疾病。一般情況下，人體內(nèi)的必須微量元素隨年齡增加在體內(nèi)逐年增加，故老年人體內(nèi)含量較低；而非必需微量元素和有害微量元素隨年齡增加在體內(nèi)逐年增加。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。細(xì)胞脫落離體或裂解為若干由單位膜包裹的凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。現(xiàn)在很多情況下，細(xì)胞凋亡亦成為程序化細(xì)胞死亡（PCD）。細(xì)胞凋亡的特殊的生物學(xué)特征：細(xì)胞核的DNA被核酸內(nèi)切酶在核小體單位之間降解，產(chǎn)生若干大小不一的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)DNA“梯形帶”，這些區(qū)帶由180~200個(gè)堿基對整數(shù)倍的寡核苷酸片段組成。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是多細(xì)胞生物中細(xì)胞死亡的兩種不同形式，它們在形態(tài)學(xué)、分子機(jī)制和生物學(xué)意義等方面有著本質(zhì)的區(qū)別。比較：第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞體積縮小，核染色質(zhì)濃縮呈半月形，胞漿濃縮，線粒體無大變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀并與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為多個(gè)具有完整的膜結(jié)構(gòu)，不出現(xiàn)溶酶體酶等細(xì)胞內(nèi)涵物外泄，故不引起炎癥反應(yīng)和次級損傷。細(xì)胞凋亡是單個(gè)細(xì)胞的丟失，結(jié)局是被吞噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞所識別、吞噬。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征：由于膜通透性增加，細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核染色質(zhì)不規(guī)則位移，進(jìn)而線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)容物外溢，引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。壞死的細(xì)胞常常是成群的細(xì)胞一起丟失。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡近年來有人認(rèn)為，凋亡與壞死沒有絕對的區(qū)別界限，在一定的條件下，凋亡可以轉(zhuǎn)化為壞死。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適量的誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)出細(xì)胞凋亡，繼續(xù)增加誘導(dǎo)劑的用量則誘導(dǎo)出壞死的改變。在體內(nèi)，如果凋亡小體不被識別，吞噬功能障礙，不能及時(shí)清除凋亡小體，凋亡小體的完整膜結(jié)構(gòu)破壞后，內(nèi)含的溶酶體釋放出來，可引起組織的壞死。凋亡、壞死比較細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死能量ATP不依賴ATP細(xì)胞形態(tài)皺縮腫脹細(xì)胞膜完整破裂細(xì)胞器形態(tài)完整腫脹破裂細(xì)胞核染色質(zhì)凝集斷裂固縮，核膜破裂凋亡小體有無DNA規(guī)律斷裂，梯狀條帶隨機(jī)降解分子機(jī)制多基因參與，有序調(diào)控?zé)o基因調(diào)控蛋白質(zhì)合成有無代謝反應(yīng)蛋白酶逐次參與無秩序反應(yīng)周圍組織炎性反應(yīng)無有對機(jī)體的影響生長發(fā)育代謝需要有損傷破壞作用圖A：細(xì)胞壞死；圖B,C：細(xì)胞凋亡左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞

細(xì)胞凋亡過程A.NormalcellB.ApoptosisC.Apoptoticbodies細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死炎癥反應(yīng)第十八章細(xì)胞衰老與死亡第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是一個(gè)正常的生理過程，它對于維持多細(xì)胞生物的生命過程中，細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡的平衡具有至關(guān)重要的意義。目前已知，細(xì)胞凋亡在動(dòng)物的機(jī)體發(fā)育過程中、在人類免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞分化成熟過程中、在機(jī)體清除受損或衰老細(xì)胞過程等方面起到重要作用。另外，細(xì)胞凋亡還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能由于細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡速度之間的平衡失調(diào)所致。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡機(jī)制在動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守。影響細(xì)胞凋亡的基因：一、基因的調(diào)控作用

ICE家族基因Fasc-mycP53Bcl-2第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡（一）ICE酶系家族白介素-1β轉(zhuǎn)換酶（ICE），是一種半胱氨酸蛋白酶，由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成。此酶系家族的前體必須在本身肽鏈的天冬氨酸基團(tuán)處斷裂加工才具有活性，這類酶本身具有催化肽鏈在天冬氨酸基團(tuán)斷裂的功能，這表明這類酶可能具有自身加工活化和互相作用加工活化的能力。ICE家族基因的過度表達(dá)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡中起著中心作用。當(dāng)這類前體活化后，在無蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄的情況下便可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡ICE家族成員（切冬酶基因家族）*第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡（二）FasFas也稱CD95或Apo-1，屬于TNF受體家族成員。這類受體是跨細(xì)胞膜的蛋白，膜外是富含絲氨酸的功能區(qū)，膜內(nèi)部分含有被稱為死亡功能域（DD）的傳遞細(xì)胞死亡信號的同源功能區(qū)。Fas在各種組織中都表達(dá)，尤其是胸腺、肝臟、心臟和腎臟中表達(dá)量很大，實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)as在T淋巴細(xì)胞凋亡過程中起作用。Fas和配體結(jié)合后啟動(dòng)形成三聚體受體，使Fas蛋白的胞質(zhì)部分召集其他幾種蛋白形成一個(gè)復(fù)合體，稱為死亡起始信號復(fù)合體（DISC）發(fā)揮使細(xì)胞凋亡的作用。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡（三）c-myc體外實(shí)驗(yàn)已證明，c-myc的重要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂。其過度表達(dá)可使細(xì)胞不再對生長滯留信號做出反應(yīng)，并使休眠期的細(xì)胞進(jìn)入繼續(xù)增殖狀態(tài)。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，c-myc過表達(dá)不僅會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，也會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，激活c-myc的轉(zhuǎn)錄同時(shí)啟動(dòng)了細(xì)胞增殖和凋亡兩種狀態(tài)，其他信號的參與決定了細(xì)胞的選擇方向。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡（四）P53P53蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)已知它可促進(jìn)P21、Bax、MDM2、周期素G等至少6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞中，P53以不具轉(zhuǎn)錄活性的休眠形式存在，接受上游信號后C末端形成的一個(gè)開放結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，P53被激活，具有結(jié)合DNA的活性。雖然P53對于正常的有絲分裂和減數(shù)分裂并不是必需的，但P53蛋白的活性和穩(wěn)定性總是以細(xì)胞周期相關(guān)的方式變化。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡P53介導(dǎo)的下游事件主要有兩個(gè)途徑：細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。1、細(xì)胞周期停滯作為對DNA的應(yīng)答，P53被激活并影響下游p21基因的轉(zhuǎn)錄，使DNA損傷的細(xì)胞停滯在G1期。2、細(xì)胞凋亡P53在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)中具有重要作用。如輻射P53缺乏鼠，其胸腺細(xì)胞、小腸和大腸的干細(xì)胞不會(huì)發(fā)生凋亡。對病毒或細(xì)胞癌基因表達(dá)以及缺失關(guān)鍵性抑癌基因Rb時(shí)做出應(yīng)答，引起細(xì)胞凋亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡（五）Bcl-2Bcl-2基因（長壽基因）：抑制凋亡Bcl-2的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)多種細(xì)胞免于多種誘因所致的細(xì)胞凋亡，它是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因。用微注射法將含有Bcl-2的重組體注入交感神經(jīng)細(xì)胞中，使其過量表達(dá)，壽命較對照組明顯延長，并發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的衰老細(xì)胞能抵抗去除血清所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。第十八章細(xì)胞衰老與死亡bcl-2基因家族*第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述（一）形態(tài)學(xué)觀察（二）流式細(xì)胞術(shù)分析（三）DNA降解分析（四）酶學(xué)分析（五）細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的分析第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述（一）形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察有普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察方法。1、普通光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的共同特征是細(xì)胞容積收縮，以細(xì)胞核的形態(tài)改變尤為突出，看不到炎癥反應(yīng)。在組織內(nèi)，細(xì)胞凋亡的典型特征是出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞，且凋亡細(xì)胞周圍有環(huán)狀帶。凋亡細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)致密聚集成斑塊狀。染色方法可用HE染色、甲基綠-派洛寧染色或吉姆薩染色。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述2、電子顯微鏡觀察在電子顯微鏡下觀察，開始時(shí)凋亡細(xì)胞體積縮小，失去細(xì)胞連接和一些特殊膜表面結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)靠近核膜，形成新月狀體。然后，核體積進(jìn)一步縮小，并可裂解為一或數(shù)個(gè)致密體，其與一定的核糖體及各種細(xì)胞器成分形成具有完整膜性結(jié)構(gòu)的凋亡小體。隨之，凋亡小體由鄰近正常細(xì)胞或吞噬細(xì)胞識別、吞噬。典型表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞染色質(zhì)固縮，?？拷四こ拭黠@的塊狀或新月狀小體，胞漿濃縮或裂解成質(zhì)膜包繞的碎片，胞質(zhì)內(nèi)可見完整的細(xì)胞器。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述3、熒光顯微鏡觀察經(jīng)吖啶橙染色后，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)可見致密濃染的黃綠色或枯黃色碎片。細(xì)胞壞死時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或枯黃色熒光減弱或消失。現(xiàn)有人利用縮時(shí)攝影術(shù)對細(xì)胞凋亡發(fā)生的整個(gè)過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，這被認(rèn)為是檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因其可排除其他形態(tài)學(xué)觀察中，固定所造成的的人為假象而使形態(tài)學(xué)指標(biāo)不能重復(fù)。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析

FCM是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的一種細(xì)胞凋亡的檢測手段，具有快速靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確客觀、重復(fù)性好、可同時(shí)檢測多種指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)?？刹捎枚喾N方法分析細(xì)胞凋亡。1、細(xì)胞形態(tài)分析2、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的改變3、細(xì)胞器改變4、細(xì)胞DNA含量分析5、凋亡相關(guān)蛋白的分析第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述1、細(xì)胞形態(tài)分析凋亡早期細(xì)胞體積縮小，形成前相散射（FSC）低，側(cè)相散射（SSC）高的特殊光散射型；細(xì)胞凋亡后期，由于染色質(zhì)濃縮和核碎裂致使FSC和SSC均減弱。缺點(diǎn)是由于其他原因引起的細(xì)胞形態(tài)改變也可出現(xiàn)這種變化，因而特異性較差。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述2、分析細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的改變一種方法是利用細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞對陽離子染料如臺盼藍(lán)拒染的特點(diǎn)，區(qū)分活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞。另一種方法是針對細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，使用熒光素標(biāo)記的抗體或配體進(jìn)行染色后，通過流式細(xì)胞儀測定。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述3、細(xì)胞器改變的分析使用綠色熒光染料羅丹明123（Rh123）作為線粒體探針。細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體膜電位降低，線粒體結(jié)合Rh123能力下降，使用流式細(xì)胞儀測定時(shí)可見Rh123熒光強(qiáng)度降低。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述4、細(xì)胞DNA含量分析這是目前最常用的凋亡分析技術(shù)之一，還可以同時(shí)分析細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡時(shí)激活核酸內(nèi)切酶，使核小體連接區(qū)出現(xiàn)廣泛DNA斷裂，產(chǎn)生很多小DNA片段。細(xì)胞在染色前的處理過程中，細(xì)胞膜通透性增加，小片段DNA溢出，再用流式細(xì)胞儀測定時(shí)，在DNA直方圖上顯示G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)DNA含量減少的亞二倍體峰，亦稱凋亡峰。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述5、凋亡相關(guān)蛋白的分析用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀可定量測定凋亡相關(guān)蛋白。6、應(yīng)用流式細(xì)胞儀在混合細(xì)胞中分選出凋亡細(xì)胞作進(jìn)一步的研究，是流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述（三）DNA降解分析這一檢測方法是基于細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA被核酸內(nèi)切酶降解，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的檢測方法。其檢測方法有：1、超速離心DNA進(jìn)行氯化銫連續(xù)梯度離心，結(jié)合溴化乙啶染色，可看到DNA片段的分帶。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述2、瓊脂糖凝膠電泳此方法是最早用于研究細(xì)胞凋亡生物化學(xué)改變特性的傳統(tǒng)經(jīng)典方法。典型的細(xì)胞凋亡圖譜出現(xiàn)“階梯帶”，壞死細(xì)胞為“涂片帶”。將末端標(biāo)記的DNA電泳后進(jìn)行放射自顯影，檢驗(yàn)敏感性可提高至少50倍以上。用此方法研究分析細(xì)胞凋亡具有較強(qiáng)的特異性，但不用于定量分析。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述3、TUNEL（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法）是一種靈敏度和特異性都較高的細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)?？捎糜跈z測細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片及冷凍或石蠟包埋的組織切片。其基本原理是首先用蛋白酶消化法在標(biāo)本細(xì)胞上打孔，把標(biāo)本與TdT酶和熒光素或生物素標(biāo)記的dUTP放在一起溫育，TdT將標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞DNA片段的3‘末端，可用流式細(xì)胞儀測定或用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度；以生物素作為標(biāo)記物的需進(jìn)一步與親和素標(biāo)記的酶及相應(yīng)底物作用顯色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。第十八章細(xì)胞衰老與死亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)概述（四）酶學(xué)分析由于caspase（半胱氨酸天冬氨酸-特異性蛋白酶）在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起到十分關(guān)鍵的作用，分析其活性比其他方法更有利于檢測細(xì)胞凋亡的早期事件。大多數(shù)caspase的作用底物不是由一種特異的caspase裂解，因此建立檢驗(yàn)特異性caspase活性的技術(shù)方法對于凋亡的檢測有重要意義。（五）細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分析細(xì)胞中Ca2﹢濃度的變化是細(xì)胞凋亡的一個(gè)特征。凋亡早期Ca2﹢濃度快速、持續(xù)升高。第十八章細(xì)胞衰老與死亡三、細(xì)胞凋亡與疾病腫瘤獲得性免疫缺陷綜合征動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致腫瘤獲得性免疫缺陷綜合征動(dòng)脈粥樣硬化第十八章細(xì)胞衰老與死亡三、細(xì)胞凋亡與疾?。ㄒ唬┘?xì)胞凋亡與腫瘤腫瘤的發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，我們已知腫瘤的發(fā)生是癌基因的激活與抑癌基因被抑制或失活共同作用的結(jié)果，同時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控異常也與腫瘤發(fā)生有關(guān)，細(xì)胞凋亡也與腫瘤關(guān)系密切。1、Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生中的作用現(xiàn)已證明Bcl-2是最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，Bcl-2基因的過度表達(dá)并不影響細(xì)胞增殖和加速細(xì)胞分裂，而是阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，延長腫瘤細(xì)胞的生存。第十八章細(xì)胞衰老與死亡三、細(xì)胞凋亡與疾病2、c-myc在細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生中的作用c-myc原癌基因是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因，其編碼的myc蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)腫瘤中表達(dá)增高。其過量表達(dá)給予細(xì)胞兩種選擇：死亡或增殖。細(xì)胞最終的選擇結(jié)果取決于細(xì)胞接受的其他