微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 28項(xiàng)目二十八：病原性真菌鑒定

項(xiàng)目二十八病原性真菌鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握菌絲、孢子的概念；單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；真菌的檢驗(yàn)方法；毛癬菌屬、表皮癬菌屬、小孢子癬菌屬的主要生物學(xué)特性和微生物學(xué)檢驗(yàn)；白假絲酵母菌、新型隱球菌的生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)及鑒定依據(jù)。2．熟悉菌孢子和細(xì)菌芽胞的不同；真菌標(biāo)本采集注意事項(xiàng)；真菌的鑒定程序及藥敏試驗(yàn)；淺部感染真菌、深部感染真菌的臨床意義；曲霉的生物學(xué)特性和微生物學(xué)檢驗(yàn)。3．了解真菌的抵抗力；與疾病、實(shí)驗(yàn)室生物安全的關(guān)系；其他真菌的生物學(xué)特性和微生物學(xué)檢驗(yàn)。4．具有正確采集和處理常見病原性真菌檢驗(yàn)標(biāo)本及進(jìn)行相關(guān)檢測的能力。5．能正確選擇試驗(yàn)項(xiàng)目對常見病原性真菌進(jìn)行檢驗(yàn)，能正確判斷和分析試驗(yàn)結(jié)果并發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。項(xiàng)目二十八病原性真菌鑒定思維導(dǎo)圖項(xiàng)目二十八病原性真菌鑒定一、真菌基本性狀一、真菌基本性狀概述真菌（fungus）屬于真核細(xì)胞型微生物，具有典型細(xì)胞核和完整細(xì)胞器，無根、莖、葉，不含葉綠素。細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和纖維素，不含肽聚糖。分為單細(xì)胞和多細(xì)胞兩類，它們?yōu)楫愷B(yǎng)生物。真菌廣泛分布于自然界，種類繁多，有10萬余種。大多數(shù)真菌對人類有益，應(yīng)用于釀酒、制醬、抗生素生產(chǎn)等領(lǐng)域。只有少數(shù)可對人和動物致病，主要引發(fā)人類感染性、中毒性或超敏反應(yīng)性疾病。）（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)一、真菌基本性狀單細(xì)胞真菌圓形或卵圓形，稱為酵母菌或類酵母菌。多以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脫落成新的獨(dú)立個體。對人致病的的主要有白色念珠菌和新型隱球菌。類酵母菌—白假絲酵母菌芽生孢子假菌絲酵母菌（孢子，無菌絲）一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)多細(xì)胞真菌（又稱絲狀真菌或霉菌）由菌絲和孢子組成，菌絲伸長分支，交織成團(tuán)。菌絲和孢子，形態(tài)因菌種不同而異，是鑒別真菌的重要標(biāo)志。多細(xì)胞真菌形態(tài)一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)菌絲形態(tài)孢子形態(tài)一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)大分生孢子的形態(tài)芽生孢子厚膜孢子一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)孢子孢子囊孢子一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)區(qū)別點(diǎn)真菌孢子細(xì)菌芽胞大小較大較小形態(tài)與位置多樣，可在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外形成圓形或卵圓形，只在細(xì)胞內(nèi)形成數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個孢子一個細(xì)菌體只能形成一個芽胞對熱抵抗力不強(qiáng)，60-70℃短時(shí)間即可被殺死強(qiáng)，耐高溫，短時(shí)間內(nèi)煮沸不被殺死作用真菌繁殖方式之一細(xì)菌休眠狀態(tài)真菌孢子與細(xì)菌芽胞的區(qū)別一、真菌基本性狀（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)另有一些真菌因寄生環(huán)境及營養(yǎng)、溫度、氧氣等培養(yǎng)條件的不同，可交替出現(xiàn)兩種形態(tài)，即在室溫中呈絲狀真菌型，而在37℃或體內(nèi)呈單細(xì)胞的酵母型，這類真菌有雙相性，所以被稱為雙態(tài)真菌或二相真菌。一、真菌基本性狀（二）真菌的繁殖1.無性繁殖：致病性真菌多是無性繁殖

真菌的無性繁殖方式主要有以下幾種形式：①出芽繁殖：酵母菌屬②芽管繁殖：大多數(shù)真菌③分裂繁殖：裂殖酵母菌④生隔繁殖2.有性繁殖

有性繁殖過程一般包括下列三個階段：①質(zhì)配②核配③減數(shù)分裂一、真菌基本性狀（三）真菌的抵抗力1.物理因素對熱抵抗力不強(qiáng)，一般加熱60～70℃短時(shí)間內(nèi)即可殺死真菌。真菌的孢子或菌絲暴露于紫外線下，均能被迅速殺死。2.化學(xué)因素對2.5%碘酊、0.1%升汞、2%石炭酸、及10%甲醛均較敏感。某些染色劑對若干真菌生長也有抑制作用3.抗生素真菌對常規(guī)抗生素均不敏感?？拐婢幬铮缁尹S霉素、兩性霉素B、克霉素、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶等對多種真菌有抑制作用。黃柏、紫草、土槿皮等中藥對真菌有抑制作用。一、真菌基本性狀（四）真菌與人類疾病1.病原性真菌感染2.條件致病性真菌感染3.超敏反應(yīng)性疾病4.真菌性中毒癥5.真菌毒素與腫瘤一、真菌基本性狀（五）真菌與實(shí)驗(yàn)室生物安全鑒于真菌的特殊性，在進(jìn)行真菌檢驗(yàn)時(shí)注意事項(xiàng)為：①真菌的分離培養(yǎng)和鑒定等實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，尤其是粗球孢子菌、組織胞漿菌、皮炎芽生菌、新型隱球菌等。②每天工作前后應(yīng)對工作區(qū)域進(jìn)行消毒滅菌，廢棄培養(yǎng)物及真菌污染的物品在清洗或丟棄前，必須經(jīng)高壓滅菌或焚燒。③為了避免孢子感染，不可試著聞平板上培養(yǎng)物產(chǎn)生的氣味。④不可對組織胞漿菌、球孢子菌等進(jìn)行玻片培養(yǎng)，以免其孢子在空氣中播散。二、真菌檢測技術(shù)項(xiàng)目二十八病原性真菌鑒定二、真菌檢測技術(shù)概述真菌的檢測技術(shù)主要包括形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、免疫檢測、核酸檢測等，其中最為常用的是直接鏡檢和分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)。二、真菌檢測技術(shù)（一）標(biāo)本的采集和鑒定程序■采集標(biāo)本注意事項(xiàng)1.標(biāo)本來源要適宜2.用藥前采集標(biāo)本3.采集的標(biāo)本量要充足4.嚴(yán)格無菌操作5.采集的標(biāo)本立即送檢。不同真菌感染應(yīng)采取不同的臨床標(biāo)本。懷疑為淺部真菌感染如體癬，應(yīng)刮取病變邊緣的痂、皮屑，發(fā)癬應(yīng)取折斷了的病發(fā)。懷疑為深部真菌感染應(yīng)取血液、腦脊液、痰、膿汁等。最長不超過2h血液和腦脊液標(biāo)本5ml，胸腔液20ml，皮屑標(biāo)本兩塊，活體組織兩份■根據(jù)真菌感染部位采集不同的標(biāo)本。淺部真菌感染---毛發(fā)、皮屑、指（趾）甲等深部真菌感染---痰液、膿汁、血液、腦脊液等二、真菌檢測技術(shù)（一）標(biāo)本的采集和鑒定程序真菌的鑒定程序二、真菌檢測技術(shù)（二）直接檢查■直接鏡檢直接鏡檢是實(shí)驗(yàn)室最簡單最有用的診斷方法,標(biāo)本不需染色,直接鏡下觀察。鏡檢若發(fā)現(xiàn)有真菌菌絲或孢子存在時(shí),可初步判定為真菌感染,但不能確定到種,需要做進(jìn)一步的檢驗(yàn)?！鋈旧R檢在載玻片上滴1滴生理鹽水,將所采集的標(biāo)本均勻涂在載玻片上,自然干燥后,火焰或甲醇固定。選擇適當(dāng)?shù)娜旧椒?染色后以高倍鏡或油鏡觀察。二、真菌檢測技術(shù)（二）直接檢查1.革蘭染色

所有真菌均為革蘭染色陽性,被染成深紫色。適用于酵母菌、孢子絲菌、組織孢漿菌及諾卡菌的檢測。2.乳酸酚棉藍(lán)染色用于各種真菌培養(yǎng)物的鏡檢,被染成藍(lán)色。3.墨汁負(fù)染色用于檢測腦脊液中的新型隱球菌。背景染成黑色,菌體不著色,在黑色背景下,可見球形透亮菌體外有折光性強(qiáng)的寬厚莢膜。4.熒光染色通常有三種方法,即直接涂片、培養(yǎng)涂片和組織切片染色。5.瑞氏染色用于組織胞漿菌和馬內(nèi)菲青霉的檢測。6.過碘酸希夫染色用于體液滲出液和組織勻漿等染色。真菌胞壁中的多糖染色后呈紅色,組織內(nèi)的糖原成分亦應(yīng)染成紅色,但經(jīng)淀粉酶消化后消失。7.嗜銀染色真菌可染成黑色,主要用于檢測組織內(nèi)真菌。常用染色方法有七種二、真菌檢測技術(shù)（三）分離培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基及作用培養(yǎng)基名稱作用沙保弱培養(yǎng)基真菌的常規(guī)培養(yǎng)放線菌酮-氯霉素瓊脂真菌的常規(guī)培養(yǎng)心腦浸液葡萄糖血瓊脂深部真菌培養(yǎng)玉米粉吐溫-80瓊脂觀察厚膜孢子（白假絲酵母菌）馬鈴薯葡萄糖瓊脂觀察真菌菌落色素尿素瓊脂生化反應(yīng)鑒別培養(yǎng)（紅色癬菌和石膏樣癬菌）真菌營養(yǎng)要求不高，在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上即可生長。最適pH4.0～6.0。在不同的培養(yǎng)基上真菌菌落形態(tài)變化很大，一般以在沙保羅培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象來描述真菌菌落形態(tài)。二、真菌檢測技術(shù)（三）分離培養(yǎng)

(1)生長速度:緩慢生長菌:7~14天;快速生長菌:2~7天。一般淺部真菌超過2周,深部真菌超過4周仍無生長,可報(bào)告陰性。(2)表面形態(tài):扁平、凸起或凹陷、皺褶等。(3)大小:菌落大小用厘米來表示,菌落大小與生長速度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。(4)菌落質(zhì)地:平滑狀、粉狀、粒狀、棉花狀、粗毛狀、皮革狀、黏液狀、膜狀。(5)菌落顏色:不同的菌種表現(xiàn)出不同的顔色。致病性真菌的顏色多較淡,呈白色或淡黃色,而且其培養(yǎng)基也可變色,如馬爾尼菲青霉等。有些真菌菌落不但正面有顏色,其背面也有深淺不同的顔色。菌落的顏色與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、移種代數(shù)等因素有關(guān)。(6)菌落的邊緣:有些菌落的邊緣整齊,有些不整齊。觀察指標(biāo)二、真菌檢測技術(shù)（四）真菌的鑒定KOH透明法標(biāo)本（膿、痰、尿、糞）皮屑等血、腦脊液沙保弱培養(yǎng)基、BA增菌培養(yǎng)鑒定：形態(tài)染色生長現(xiàn)象生化反應(yīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)果初報(bào)結(jié)果報(bào)告二、真菌檢測技術(shù)（五）真菌的藥敏試驗(yàn)按美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)，抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)常用肉湯稀釋法，包括常量稀釋法和微量稀釋法。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類多烯類：如兩性霉素B、制霉菌素等。吡咯類：如酮康唑、伊曲康唑等。其他：如氟胞嘧啶。根據(jù)作用機(jī)制分類作用于真菌細(xì)胞膜：如兩性霉素B等。作用于真菌細(xì)胞壁：如尼可霉素Z等。干擾真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等。其他：如大蒜新素及冰醋酸等三、常見病原性真菌鑒定項(xiàng)目二十八病原性真菌鑒定（一）淺部感染真菌1.皮膚癬真菌（1）生物學(xué)特性1）表皮癬菌屬

鏡下：棒狀薄壁大分生孢子，有分隔；成熟

菌落中可見厚膜孢子菌落：SDA上菌落開始呈白色鵝毛狀，后轉(zhuǎn)

變?yōu)辄S綠色粉末狀絮狀表皮癬菌大分生孢子、厚膜孢子及菌落（1）生物學(xué)特性2）毛癬菌屬

鏡下：細(xì)長棒狀薄壁的大分生孢子；葡萄狀或梨狀的小分生孢子；菌絲形態(tài)多樣，呈

螺旋狀、球拍狀、鹿角狀或結(jié)節(jié)狀菌落：SDA上菌落呈絨毛狀、粉末狀或蠟狀；菌落顏色為白色、紅色、橙色、黃色、

奶油色及紫色等紅色毛癬菌大分生孢子、小分生孢子及菌落（一）淺部感染真菌1.皮膚癬真菌（1）生物學(xué)特性3）小孢子菌屬

鏡下：厚壁梭形大分生孢子；卵圓形小分生孢子；

菌絲有隔，呈梳狀、結(jié)節(jié)狀和球拍狀菌落：SDA上形成灰色、橘紅色或棕黃色，絨毛狀

或粉末狀的菌落犬小孢子菌大分生孢子及菌落（一）淺部感染真菌1.皮膚癬真菌（2）微生物學(xué)檢驗(yàn)1）標(biāo)本采集皮屑、甲屑、病發(fā)2）檢驗(yàn)方法①直接鏡檢：觀察菌絲及孢子形態(tài)特征。②分離培養(yǎng)與鑒定：觀察菌落特征及鏡下結(jié)構(gòu)，必要時(shí)做鑒定試驗(yàn)（毛發(fā)穿孔試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)和特殊營養(yǎng)需要試驗(yàn)）。（一）淺部感染真菌1.皮膚癬真菌1.白假絲酵母菌（1）生物學(xué)特性圓形或卵圓形，G+,以芽生孢子出芽繁殖，可形成假菌絲。在組織內(nèi)易形成芽生孢子和假菌絲。在SDA上形成類酵母型菌落，在玉米培養(yǎng)基上可長出厚膜孢子。能同化多種糖，不能利用硝酸鹽，尿素酶陰性。白假絲酵母菌厚膜孢子、假菌絲、芽生孢子及菌落（二）深部感染真菌（2）微生物學(xué)檢驗(yàn)1）標(biāo)本：分泌物、痰、尿、糞、血或腦脊液等2）檢驗(yàn)方法及鑒定①直接鏡檢：G+，著色不均的圓形或卵圓形芽生孢子或有假菌絲。②分離培養(yǎng)：奶油色、類酵母型菌落，鏡檢可見芽生孢子和假菌絲。③鑒定實(shí)驗(yàn)：芽管形成試驗(yàn)、厚膜孢子形成試驗(yàn)、TTC試驗(yàn)、糖同化或發(fā)酵試驗(yàn)。④其他檢測：抗原檢測、抗體檢測、G試驗(yàn)、核酸檢測、動物試驗(yàn)。⑤藥敏試驗(yàn)芽管形成試驗(yàn)厚膜孢子形成試驗(yàn)顯色培養(yǎng)基（二）深部感染真菌1.白假絲酵母菌（1）生物學(xué)特性圓形或卵圓形，常采用墨汁負(fù)染色后鏡檢，有寬厚莢膜，以出芽方式繁殖。營養(yǎng)要求不高，在SDA上形成酵母型菌落，初為乳白色小菌落，漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色，終為棕褐色?？煞纸饽蛩兀芡鞣N碳水化合物，但不發(fā)酵糖。新型隱球菌莢膜、孢子及菌落（二）深部感染真菌2.新型隱球菌（2）微生物學(xué)檢驗(yàn)1）標(biāo)本采集：腦脊液、痰液、尿液、膿汁、活體組織及尸體解剖材料等2）檢驗(yàn)方法①直接鏡檢：革蘭染色可見G+的球形或卵圓形孢子，墨汁負(fù)染色可見黑色背景下圓形孢子，周圍有透光的厚莢膜。②分離培養(yǎng)：形成酵母型菌落，菌落初為白色、光滑、奶油樣，漸變?yōu)榈稚?、黏液樣。③鑒定試驗(yàn)：酚氧化酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、糖同化及發(fā)酵試驗(yàn)。④其他檢測：抗原檢測、抗體檢測、核酸檢測、動物試驗(yàn)。⑤藥敏試驗(yàn)（二）深部感染真菌2.新型隱球菌菌絲：有隔，多細(xì)胞性，有分枝；足細(xì)胞接觸培養(yǎng)基的部分，厚壁而膨大分生孢子梗：從足細(xì)胞直立生長頂囊：孢子梗頂端膨大，半球形或橢圓形小梗：頂囊上，輻射狀，一層或二層桿狀分生孢子：小梗頂端，成串，球形，不同顏色分生孢子頭：菊花樣的頭狀結(jié)構(gòu)，因菌種不同而呈不同顏色煙曲霉黃曲霉黑曲霉構(gòu)巢曲霉土曲霉（二）深部感染真菌3.曲霉菌落：在沙保培養(yǎng)基上形成絲狀菌落，由于產(chǎn)生分生孢子而漸呈現(xiàn)不同顏色煙曲霉菌落黃曲霉菌落黑曲霉菌落構(gòu)巢曲霉菌落土曲霉菌落（二）深部感染真菌3.曲霉在沙保培養(yǎng)基上形成絲狀菌落，鏡下可見孢子囊梗、孢子囊、孢子囊孢子。引起毛霉病。毛霉菌落孢子囊與孢子囊孢子（二）深部感染真菌4.毛霉在沙保培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)形成絲狀菌落，鏡下可見特征性的齒輪狀大分生孢子。莢膜組織胞漿菌菌落（25℃）莢膜組織胞漿菌大分生孢子（二）深部感染真菌5.莢膜組織胞漿菌姬姆薩染色，可見孢囊內(nèi)的8個孢子；亞甲胺藍(lán)染色，孢囊囊壁呈深褐色或黑色，孢子不著色。是條件致病菌，引起卡氏肺孢菌性肺炎。Giemsa染色，卡氏肺孢菌包囊亞甲胺蘭染色，卡氏肺孢菌包囊（二）深部感染真菌6.卡氏肺孢子菌鏡下可見透明、分隔菌絲，分生孢子梗光滑而無頂囊；帚狀分枝，雙輪生，散在，稍不對稱，有2～7個散在、不平行的梗基，其上有2～6個瓶梗，頂端狹窄，可見單瓶梗，其頂