微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 22項(xiàng)目二十二：彎曲桿菌和幽門螺桿菌鑒定

項(xiàng)目二十二彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1.掌握彎曲菌屬和幽門螺桿菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。2.熟悉彎曲菌屬和幽門螺桿菌的主要生物學(xué)特性。3.了解常見彎曲菌屬和幽門螺桿菌的臨床意義。4.具有正確采集和處理常見彎曲菌屬和幽門螺桿菌檢驗(yàn)標(biāo)本及進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的能力。5.能正確選擇試驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)彎曲菌屬和幽門螺桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)，能正確判斷和分析試驗(yàn)結(jié)果并發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。項(xiàng)目二十二彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定項(xiàng)目二十二彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定思維導(dǎo)圖彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定微生物學(xué)檢驗(yàn)生物學(xué)特性臨床意義彎曲菌屬的鑒定幽門螺桿菌的鑒定微生物學(xué)檢驗(yàn)生物學(xué)特性臨床意義一、彎曲菌屬的鑒定項(xiàng)目二十二彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定一、彎曲菌屬的鑒定概述

彎曲菌屬（Campylobacter）細(xì)菌是1973年由Veron等建議確定的一個(gè)與人類疾病有關(guān)的新菌屬，屬于螺菌科。該菌屬細(xì)菌是一類微需氧，菌體彎曲呈逗點(diǎn)狀、S形或螺旋狀，不分解糖類、氧化酶陽(yáng)性，有動(dòng)力的革蘭氏陰性菌。包括5個(gè)種和5個(gè)亞種。對(duì)人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種?？漳c彎曲菌是人類腹瀉最常見的病原菌之一，胎兒彎曲菌胎兒亞種在免疫功能低下時(shí)可引起敗血癥、腦膜炎等。1.形態(tài)與染色：革蘭氏陰性、細(xì)長(zhǎng)、螺旋形或海鷗展翅狀、S形的彎曲桿菌。陳舊培養(yǎng)物可呈球形或長(zhǎng)絲狀。大小為（0.5～8）μm×（0.2～0.5）μm。一端或兩端具有單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，有時(shí)呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)。一、彎曲菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性2.培養(yǎng)特性：微需氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求高，在普通培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，需加血液、血清。常用的選擇培養(yǎng)基有Skirrow瓊脂、Butzler培養(yǎng)基和Campy-BAP培養(yǎng)基。初次分離時(shí)，經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)可形成兩種菌落：一種為扁平濕潤(rùn)、灰白色半透明、邊緣不整齊、常延接種線擴(kuò)散生長(zhǎng)的菌落；另一種為圓形凸起、半透明、針尖狀、有光澤、單個(gè)細(xì)小菌落。兩種菌落均不溶血。在布氏肉湯內(nèi)呈均勻渾濁生長(zhǎng)。一、彎曲菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性3.生化反應(yīng)：生化反應(yīng)

該菌屬生化反應(yīng)不活潑。氧化酶均為陽(yáng)性，大多數(shù)彎曲菌還能還原硝酸鹽，觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，空腸彎曲菌馬尿酸水解試驗(yàn)陽(yáng)性。不分解糖類、不液化明膠、不分解尿素，V-P和甲基紅試驗(yàn)均陰性。4.抗原結(jié)構(gòu)：有菌體（O）抗原、熱不穩(wěn)定抗原和鞭毛（H）抗原。根據(jù)O抗原可將空腸彎曲菌分為42個(gè)血清型。5.抵抗力：較弱，56℃5分鐘即被殺死。干燥環(huán)境中僅能存活3小時(shí)。一、彎曲菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性

主要引起人類腸道感染和各種腸道外感染。本菌屬中的空腸彎曲菌是引發(fā)散發(fā)性細(xì)菌性腸炎的最常見菌種之一，胎兒彎曲菌主要引起腸道外感染，其中胎兒亞種為主要的人類致病菌。對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素敏感，多數(shù)空腸彎曲菌對(duì)氨基糖甙類、氯霉素及氟喹諾酮類敏感，由于可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，一般對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。一、彎曲菌屬的鑒定（二）臨床意義1.標(biāo)本采集：根據(jù)不同患者類型采集糞便或肛拭子、血液、膿汁、腦脊液、尿液等標(biāo)本送檢。2.檢驗(yàn)方法（1）直接涂片檢查1）懸滴標(biāo)本檢查：取新鮮糞便于載玻片上，加生理鹽水混合后，覆蓋蓋玻片置顯微鏡下觀察有無(wú)投鏢式或螺旋狀運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌。腦脊液經(jīng)3000r/min離心沉淀15min后，制成涂片做懸滴檢查。2）革蘭染色檢查：革蘭陰性逗點(diǎn)狀、S形或螺旋狀小桿菌。一、彎曲菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（2）分離培養(yǎng)：糞便和肛拭子標(biāo)本直接接種于改良彎曲菌瓊脂平板，如改良的Skirrow血瓊脂平板和Campy-BAP平板；血液或腦脊液標(biāo)本接種布氏肉湯增菌后，轉(zhuǎn)種彎曲菌分離培養(yǎng)基，置43℃、37℃，在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)(24-72)小時(shí)，觀察菌落特征。一、彎曲菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（3）生化鑒定：?jiǎn)伪廾哂型剁S樣或螺旋樣動(dòng)力，需氧環(huán)境不生長(zhǎng)，微需氧條件下，在彎曲菌選擇培養(yǎng)基上形成兩種類型菌落，不分解葡萄糖。彎曲菌屬的鑒定要點(diǎn)為氧化酶陽(yáng)性、革蘭氏陰性、菌體彎曲或呈S形。最常用的鑒定試驗(yàn)有生長(zhǎng)溫度（25℃、37℃、42℃）試驗(yàn)、過(guò)氧化氫試驗(yàn)、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)、硝酸鹽和亞硝酸鹽還原試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等。一、彎曲菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)一、彎曲菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)觸酶25℃生長(zhǎng)42℃生長(zhǎng)1%甘氨酸H2S馬尿酸鹽3.5%NaCl胎兒彎曲菌胎兒亞種++v+---胎兒彎曲菌性病亞種v+-----空腸彎曲菌v-+/-+-vv大腸彎曲菌+-++v--唾液彎曲菌糞亞種+-+++--唾液彎曲菌唾液亞種--+++--黏膜彎曲桿菌--+v+--簡(jiǎn)明彎曲菌--vv+--彎曲菌屬主要菌種的鑒別要點(diǎn)二、幽門螺桿菌的鑒定項(xiàng)目二十二彎曲菌屬和幽門螺桿菌鑒定二、幽門螺桿菌的鑒定

幽門螺旋桿菌是一類革蘭氏陰性桿菌，菌體細(xì)長(zhǎng)，呈弧形、S型和螺旋狀，陳舊培養(yǎng)物可呈球桿型。一端多根帶鞘鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，無(wú)芽胞。微需氧，在含5%O2、10%CO2、和85%N2氣體環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在大氣中和絕對(duì)厭氧條件下不生長(zhǎng)。最適溫度37℃，最適PH7.0，生長(zhǎng)時(shí)需要一定濕度，以相對(duì)濕度98%為宜。營(yíng)養(yǎng)要求高，一般需含血液或血清才能生長(zhǎng)。生化反應(yīng)不活潑，不能利用糖類，氧化酶陽(yáng)性，觸酶陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性。主要分布在獼猴、大鼠、豬、犬等動(dòng)物的胃粘膜組織中，67%-80%的胃潰瘍和95%的十二指腸潰瘍是由幽門螺旋桿菌引起的。（一）生物學(xué)特性

人群中感染幽門螺桿菌非常普遍，胃竇為其定植的最佳部位。幽門螺桿菌的感染與萎縮性胃炎或慢性淺表性胃炎之間的病因關(guān)系已確立，流行病學(xué)資料表明本菌的感染與胃竇和胃體部位的胃腺癌密切相關(guān)。此外，幽門螺桿菌還和胃黏膜相關(guān)B細(xì)胞淋巴瘤密切關(guān)聯(lián)，針對(duì)本菌的治療可以使淋巴瘤得到緩解。本菌具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是多種因素，如細(xì)菌的鞭毛、黏附素、尿素酶、蛋白酶、空泡毒素、內(nèi)毒素等協(xié)同作用的結(jié)果。（二）臨床意義二、幽門螺桿菌的鑒定1.標(biāo)本采集

通過(guò)胃鏡用活檢鉗從近幽門部、胃竇部或病變的鄰近處采取多位點(diǎn)樣品，置運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢，注意防止干燥。如不能及時(shí)送檢，可置4℃冰箱保存，時(shí)間不超過(guò)5小時(shí)。受檢者需術(shù)前停服鉍劑或抗菌藥物一周。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（1）直接顯微鏡檢查1）將活檢的組織切碎并研磨均勻，涂片或懸滴，置暗視野或相差顯微鏡下觀察，幽門螺桿菌形態(tài)典型，呈典型“投鏢樣”運(yùn)動(dòng)。2）革蘭染色檢查：將活檢的粘膜組織涂片后，革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)典型形態(tài)的幽門螺桿菌即可診斷。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（1）直接顯微鏡檢查3）組織切片染色鏡檢：組織塊經(jīng)固定、切片后W-S銀染色、吉姆薩染色、HE染色和熒光染色等染色后鏡檢幽門螺桿菌。4）免疫組化檢查：可檢出胃黏膜組織切片中完整的幽門螺桿菌及破碎的菌體或抗原成分。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（2）分離培養(yǎng)

應(yīng)選用新鮮配制的培養(yǎng)基，非選擇性培養(yǎng)基可用巧克力瓊脂和含5%羊血的Brucella瓊脂，選擇培養(yǎng)基可用Skirrow瓊脂和改良的Thayer-Martin瓊脂。將研磨均勻的標(biāo)本接種培養(yǎng)基后在微需氧、濕潤(rùn)的環(huán)境中培養(yǎng)(72-96)小時(shí)，方可見細(xì)小、圓形、光滑、半透明的菌落。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（3）生化鑒定本菌生化反應(yīng)不活潑，不能利用糖類，氧化酶陽(yáng)性，觸酶陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性，含尿素酶豐富，可迅速分解尿素釋放氨，將標(biāo)本種入尿素培養(yǎng)基，陽(yáng)性者培養(yǎng)基由黃變紅，可作為鑒定該菌的主要依據(jù)。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法（4）尿素呼吸試驗(yàn)?zāi)蛩睾粑囼?yàn)是臨床用于檢測(cè)幽門螺桿菌感染的一種方法。被檢者空腹，口服含同位素13C或14C的尿素，幽門螺桿菌產(chǎn)生的豐富脲酶可以使尿素分解產(chǎn)生標(biāo)有同位素的CO2，后試驗(yàn)方法。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)2.檢驗(yàn)方法(5)糞便抗原檢測(cè)可采用酶免方法直接測(cè)定糞便標(biāo)本中的抗原。適用于不能進(jìn)行胃鏡檢查和13C或14C標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)患者。（6）PCR檢查從克隆的幽門螺桿菌染色體DNA的特異性片段中構(gòu)建引物或從Hp脲酶A基因序列中構(gòu)建引物，用PCR擴(kuò)增并結(jié)合限制性酶切多態(tài)性分析技術(shù)鑒別幽門螺桿菌，可檢測(cè)出不能分離培養(yǎng)的幽門螺桿菌。二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)螺桿菌屬主要菌種的特異性二、幽門螺桿菌的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)菌種觸酶硝酸鹽還原堿性磷酸酶脲酶醋酸吲哚酚水解γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶42℃生長(zhǎng)1%甘氨酸萘啶酸頭孢噻吩畢氏螺桿菌+++++++-RS犬螺桿菌--+-+++-SI加拿大螺桿菌++/---+-++RR同性戀螺桿菌++-----+SI菲氏螺桿菌+-+-+--+SS幼禽螺桿菌++---ND+-RS幽門螺桿菌+-++-+--RS螺桿菌中“曲撓”菌株+/---+-++-RR溫哈門螺桿菌----+ND-+RR

彎曲菌屬細(xì)菌是一類微需氧菌，不分解糖類、氧化酶陽(yáng)性，菌體彎曲，有動(dòng)力的革蘭氏陰性菌。包括5個(gè)種和5個(gè)亞種。對(duì)人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種。主要引起人類腸道感染和各種腸道外感染。該菌屬中的空腸彎曲菌是引發(fā)散發(fā)性細(xì)菌性腸炎的最常見菌種之一，胎兒彎曲菌主要引起腸道外感染，其中胎兒亞種為主要的人類致病菌。該菌屬常對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素敏感。幽門螺桿菌是