免疫學檢驗技術-放射免疫技術

知識目標1.掌握放免技術的基本概念及類型2.掌握RIA和IRMA的測定原理及關鍵技術（重難點）。3.熟悉放射標記物的鑒定與純化。4.熟悉RIA和IRMA的臨床應用與評價能力目標運用放射免疫技術分析和解決臨床檢驗實際問題。思政-素質目標責任心、細心、生物安全意識、質控意識教學目標目錄一放射性核素和放射性標記物的制備二放射免疫分析三免疫放射分析應用放射性核素標記抗原或抗體，通過免疫反應進行定量測定。前言將放射性核素高敏感的示蹤特點和抗原抗體反應的高特異性特點相結合的一種體外測定超微量物質的新技術。放射免疫技術基本模式放射免疫分析免疫放射分析IRMA

方法學評價分類RIA靈敏度高特異性強重復性好樣品及試劑用量少操作簡便易于標準化第一節(jié)放射性核素和放射性標記物的制備放射性核素作為放射性免疫技術的標記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術的基礎。一、放射性核素的基本知識基本概念指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉化，由一種放射性核素轉變成另一種放射性核素，并同時釋放射線（α、β、γ），又稱為放射性衰變?；绢愋鸵罁?jù)其衰變方式α衰變、β衰變、γ衰變最常用的放射性核素是125I

125I的優(yōu)點化學性質比較活潑，標記方法簡單，且容易獲得高比活性的標記物；在衰變過程中產生γ射線，便于測量且效率高；半衰期適中（60天左右），且廢棄物較容易處理。125I的缺點用125I取代H，可能使原物質免疫活性受到影響；易因發(fā)生輻射損傷而使標記抗原變性；作為商品化試劑的產品貨架期較短。放射性核素放射活性的檢測利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍體發(fā)出一定波長的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號經過放大器放大，經單道分析器甄別處理，并在定標器上顯示。二、放射性核素標記抗原抗體方法主要包括間接標記法直接標記法（氯胺T法）125I-125I或125I+125I-標記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應（一）直接標記法——氯胺T法（Ch-T）

氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標記物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應。使用無還原劑的高比放射性碘源被標記物用量要少Ch-T用量要低控制總反應體積<200μl反應時間1分鐘~2分鐘弱堿性反應條件（二）間接標記法預先將125I用Ch-T法標記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應，從而使待標記物被碘化。三、放射標記物的純化與鑒定（一）放射標記物的純化因游離的125I與125I標記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進行分離純化聚合、損傷物標記蛋白游離125I比放射活性高比放射性高純度完整免疫活性放射化學純度單位標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率應大于95%

免疫活性標記物與抗體結合的能力標記物與過量抗體反應百分比該值越大,標記物免疫活性好（二）放射標記物的鑒定計算法自身置換法

比放射活性單位化學量標記物中所含的放射性強度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過高，將影響標記物免疫活性比放射性－計算法

結果欠準，計算簡便依據(jù)標記反應中放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射性.比放射性－自身置換法比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性。作一條常規(guī)的RIA標準曲線，反應體系包括定量標記抗原、不同濃度的非標記標準品抗原、限量抗體；同時另作一條不加非標記標準品、只加抗體和不同劑量的標記抗原的自身置換曲線。自身置換曲線

標準曲線

反應平衡后，測定B/T%。若從兩條曲線上取一點相同的B/T%，則（標記物+標準品）標準曲線=（標記物）自身置換曲線。由此便可直接計算標記抗原的含量，并進一步求得比放射活性。自身置換法測定標記化合物的比放射活性，只適用于RIA的標記抗原。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；②非特異性結合應較小，且計算時應扣除；③制備標準曲線與自身置換曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。第二節(jié)放射免疫分析

放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標記的抗原（Ag*）與未標記抗原（Ag）競爭結合特異抗體（Ab）來對待檢樣品中的抗原進行定量測定的一種技術。一、檢測原理RIA屬于競爭性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待測物Ag)對特異性抗體具有相同的結合力，當三者同時存在于同一反應體系時，Ag*和Ag相互競爭結合特異性抗體。Ag*和Ag具有等同的與Ab結合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結合位點，二者通過競爭方式與Ab結合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。(標準Ag/樣品Ag)二、方法與類型非平衡法，即標準品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標記抗原與特異性抗體達到平衡，然后再加入標記抗原競爭與抗體結合。兩種類型平衡法，即標記抗原、標準品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時加入反應體系中。三、關鍵技術抗原抗體反應分離結合標記物（分離技術）放射性測定數(shù)據(jù)處理Ag*Ag反應條件體積溫度時間pHAb(標準Ag/樣品Ag)（一）抗原抗體反應牢固的抗原抗體復合物二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響操作應簡單、重復性好經濟（二）分離結合標記物晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理標準曲線

RIA由于具有敏感度高、特異性強、精密度高、重復性好、用血量少、可測定小分子量和大分子量物質等優(yōu)點，在醫(yī)學檢驗中應用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測定。

但由于放射性核素的放射性對人體會產生一定的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成污染，因此操作時必須加以注意。四、評價與應用第三節(jié)免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是從放射免疫分析（RIA）的基礎上發(fā)展起來的核素標記免疫測定，其特點為用核素標記的抗體直接與待檢抗原反應，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段。一、檢測原理IRMA屬于非競爭性免疫結合反應，其基本檢測原理是將放射性核素（125I）標記在抗體上，并用過量的標記抗體與待測抗原進行非競爭性結合反應，并采用固相免疫吸附方式對B和F進行分離。檢測免疫復合物的放射性，從而得到待檢樣本的濃度。二、方法與類型（一）單位點IRMA（二）雙位點IRMA三、關鍵技術抗原抗體反應分離技術放射性測定數(shù)據(jù)處理Ab*AgAb(待檢Ag)（一）抗原抗體反應固相抗原抗體復合物*牢固的抗原抗體復合物固相吸附分離技術（二）分離技術一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預包被抗體稀釋到3μg/ml~10μg/ml，室溫過夜，棄包被緩沖液（含有未結合物質和過剩標記物），并洗滌去掉結合不牢固抗體，從而達到分離的目的；然后，再加入1%牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆谩＞w閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理

IRMA的優(yōu)點

效率高、操作簡便

靈敏度高

特異型強

穩(wěn)定性好四、評價與應用

IRMA的缺點

抗體用量較多

抗體的純化較難RMA的測定對象主要限于有兩個以上抗原決定簇的肽類或蛋白質。抗體適用于大分子蛋白質和多肽類激素的檢測分析，如腫瘤標志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降鈣素、HBsAg等，某些難以標記的病毒抗原也可通過IRMA進行檢測。小結

放射免疫技術是應用放射性核素標記抗原或抗體，通過免疫反應進行定量測定的一種技術。有兩種類型經典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射分析（IRMA）。

放射免疫分析是待測抗原和定量的標記抗原競爭性結合限量的抗體;免疫放射分析是將放射性物質標記在抗體上，屬于非競爭性免疫結合反應。

放射性免疫技術靈敏度高、特異性強，常用于微量物質的定量測定。但由于放射性核素的放射性對人體和環(huán)境會產生一定的危害和污染，因此操作時必須加以注意。知識目標1.掌握放免技術的基本概念及類型2.掌握RIA和IRMA的測定原理及關鍵技術（重難點）。3.熟悉放射標記物的鑒定與純化。4.熟悉RIA和IRMA的臨床應用與評價能力目標運用放射免疫技術分析和解決臨床檢驗實際問題。思政-素質目標責任心、細心、生物安全意識、質控意識教學目標目錄一放射性核素和放射性標記物的制備二放射免疫分析三免疫放射分析應用放射性核素標記抗原或抗體，通過免疫反應進行定量測定。前言將放射性核素高敏感的示蹤特點和抗原抗體反應的高特異性特點相結合的一種體外測定超微量物質的新技術。放射免疫技術基本模式放射免疫分析免疫放射分析IRMA

方法學評價分類RIA靈敏度高特異性強重復性好樣品及試劑用量少操作簡便易于標準化第一節(jié)放射性核素和放射性標記物的制備放射性核素作為放射性免疫技術的標記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術的基礎。一、放射性核素的基本知識基本概念指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉化，由一種放射性核素轉變成另一種放射性核素，并同時釋放射線（α、β、γ），又稱為放射性衰變?；绢愋鸵罁?jù)其衰變方式α衰變、β衰變、γ衰變最常用的放射性核素是125I

125I的優(yōu)點化學性質比較活潑，標記方法簡單，且容易獲得高比活性的標記物；在衰變過程中產生γ射線，便于測量且效率高；半衰期適中（60天左右），且廢棄物較容易處理。125I的缺點用125I取代H，可能使原物質免疫活性受到影響；易因發(fā)生輻射損傷而使標記抗原變性；作為商品化試劑的產品貨架期較短。放射性核素放射活性的檢測利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍體發(fā)出一定波長的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號經過放大器放大，經單道分析器甄別處理，并在定標器上顯示。二、放射性核素標記抗原抗體方法主要包括間接標記法直接標記法（氯胺T法）125I-125I或125I+125I-標記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應（一）直接標記法——氯胺T法（Ch-T）

氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標記物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應。使用無還原劑的高比放射性碘源被標記物用量要少Ch-T用量要低控制總反應體積<200μl反應時間1分鐘~2分鐘弱堿性反應條件（二）間接標記法預先將125I用Ch-T法標記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應，從而使待標記物被碘化。三、放射標記物的純化與鑒定（一）放射標記物的純化因游離的125I與125I標記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進行分離純化聚合、損傷物標記蛋白游離125I比放射活性高比放射性高純度完整免疫活性放射化學純度單位標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率應大于95%

免疫活性標記物與抗體結合的能力標記物與過量抗體反應百分比該值越大,標記物免疫活性好（二）放射標記物的鑒定計算法自身置換法

比放射活性單位化學量標記物中所含的放射性強度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過高，將影響標記物免疫活性比放射性－計算法

結果欠準，計算簡便依據(jù)標記反應中放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射性.比放射性－自身置換法比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性。作一條常規(guī)的RIA標準曲線，反應體系包括定量標記抗原、不同濃度的非標記標準品抗原、限量抗體；同時另作一條不加非標記標準品、只加抗體和不同劑量的標記抗原的自身置換曲線。自身置換曲線

標準曲線

反應平衡后，測定B/T%。若從兩條曲線上取一點相同的B/T%，則（標記物+標準品）標準曲線=（標記物）自身置換曲線。由此便可直接計算標記抗原的含量，并進一步求得比放射活性。自身置換法測定標記化合物的比放射活性，只適用于RIA的標記抗原。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；②非特異性結合應較小，且計算時應扣除；③制備標準曲線與自身置換曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。知識目標1.掌握放免技術的基本概念及類型2.掌握RIA和IRMA的測定原理及關鍵技術（重難點）。3.熟悉放射標記物的鑒定與純化。4.熟悉RIA和IRMA的臨床應用與評價能力目標運用放射免疫技術分析和解決臨床檢驗實際問題。思政-素質目標責任心、細心、生物安全意識、質控意識教學目標目錄一放射性核素和放射性標記物的制備二放射免疫分析三免疫放射分析

放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標記的抗原（Ag*）與未標記抗原（Ag）競爭結合特異抗體（Ab）來對待檢樣品中的抗原進行定量測定的一種技術。二放射免疫分析一、檢測原理RIA屬于競爭性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待測物Ag)對特異性抗體具有相同的結合力，當三者同時存在于同一反應體系時，Ag*和Ag相互競爭結合特異性抗體。Ag*和Ag具有等同的與Ab結合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結合位點，二者通過競爭方式與Ab結合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。(標準Ag/樣品Ag)二、方法與類型非平衡法，即標準品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標記抗原與特異性抗體達到平衡，然后再加入標記抗原競爭與抗體結合。兩種類型平衡法，即標記抗原、標準品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時加入反應體系中。三、關鍵技術抗原抗體反應分離結合標記物（分離技術）放射性測定數(shù)據(jù)處理Ag*Ag反應條件體積溫度時間pHAb(標準Ag/樣品Ag)（一）抗原抗體反應牢固的抗原抗體復合物二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響操作應簡單、重復性好經濟（二）分離結合標記物晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理標準曲線

RIA由于具有敏感度高、特異性強、精密度高、重復性好、用血量少、可測定小分子量和大分子量物質等優(yōu)點，在醫(yī)學檢驗中應用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測定。

但由于放射性核素的放射性對人體會產生一定的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成污染，因此操作時必須加以注意。四、評價與應用知識目標1.掌握放免技術的基本概念及類型2.掌握RIA和IRMA的測定原理及關鍵技術（重難點）。3.熟悉放射標記物的鑒定與純化。4.熟悉RIA和IRMA的臨床應用與評價能力目標運用放射免疫技術分析和解決臨床檢驗實際問題。思政-素質目標責任心、細心、生物安全意識、質控意識教學目標目錄一放射性核素和放射性標記物的制備二放射免疫分析三免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是從放射免疫分析（RIA）的基礎上發(fā)展起來的核素標記免疫測定，其特點為用核素標記的抗體直接與待檢抗原反應，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段。三免疫放射分析一、檢測原理IRMA屬于非競爭性免疫結合反應，其基本檢測原理是將放射性核素（125I）標記在抗體上，并用過量的標記抗體與待測抗原進行非競爭性結合反應，并采用固相免疫吸附方式對B和F進行分離。檢測免疫復合物的放射性，從而得到待檢樣本