DB2305-T 040-2024水稻紋枯病菌分離及鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB16

DB2305雙 鴨 山 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB2305/T040—2024水稻紋枯病菌分離及鑒定技術(shù)規(guī)程2024-08-302024-08-302024-09-30雙鴨山市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB2305/T040DB2305/T040—2024前??言本文件按照GB/T1.1—20201草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由雙鴨山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院、寶清縣小城子鎮(zhèn)鄉(xiāng)村振興發(fā)展服務(wù)中心、蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院。本文件主要起草人：楊曉賀、姚亮亮、于昌紅、顧鑫、吳彥龍、高忠臣、丁俊杰、高雪冬、邱磊、張茂明、王自杰、張家智、付久才、馬瑞、劉偉、王慶勝、黃成亮。IIDB2305/T040DB2305/T040—2024DB2305/T040—20244.1.4光學(xué)顯微鏡目鏡10×，物鏡DB2305/T040—20244.1.4光學(xué)顯微鏡目鏡10×，物鏡10×、40×。4.1.5電子天平感量0.01g。4.1.6常用工具剪刀、培養(yǎng)皿、吸水紙、接種針、試管、酒精燈、記號筆、載玻片、蓋玻片、鑷子，醫(yī)用紗布等。水稻紋枯病菌分離及鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了水稻紋枯病樣本的采集與保存，病原菌的分離、純化、鑒定及保存技術(shù)要求。本文件適用于水稻紋枯病菌的分離和鑒定。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1水稻紋枯病附錄A。3.2單菌絲分離4儀器和用具常用儀器超凈工作臺潔凈等級100級@≥0.5um。平均風(fēng)速0.25m/s～0.6m/s。高壓滅菌鍋穩(wěn)定范圍0℃～135℃。滅菌時間范圍4min～120min，最高工作壓力0.22MPa～0.25MPa。光照培養(yǎng)箱穩(wěn)定范圍0℃～50℃。穩(wěn)定波動±1℃。光照度0LX～7500LX。1樣本采集與保存水稻成熟期從田間剪取發(fā)病莖稈（其特征見附錄B），按品種及采集地裝入牛皮紙袋，貼上標(biāo)簽，注明采集時間、地點和水稻品種，帶回實驗室。放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩７蛛x技術(shù)培養(yǎng)基的配制6.1.1水瓊脂培養(yǎng)基6.1.1水瓊脂培養(yǎng)基20g1000mL2%水瓊脂培養(yǎng)基。12125min。6.1.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）200g1000mL25min20g，再煮沸后加入葡萄糖20g，加水定容至1000mL，121℃濕熱滅菌25min。病菌分離2mm×5mm525℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（見C）。培養(yǎng)24h（見PDA將水稻紋枯病菌置于水瓊脂平板上，25℃培養(yǎng)2d后，用切刀切取菌絲前端約1mm長度的菌絲置于水瓊脂平板上，25℃培養(yǎng)。如此操作3次。7菌種保存2將6.3純化的菌株轉(zhuǎn)入PDA試管斜面內(nèi)，25℃培養(yǎng)15d，放置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫ㄒ姼戒汦）。病原菌的鑒定（附錄F）進(jìn)行比對，確定其為水稻紋枯病菌。病原菌的致病性測定將牙簽剪成1cm短簽，經(jīng)121℃濕熱滅菌30min后，將短簽放置在PDA平板上，1個PDA平板內(nèi)放置20個左右短牙簽。將待測菌株接種至裝有短牙簽的PDA平板內(nèi)，28℃培養(yǎng)7d～10d，將帶有菌絲的短牙簽接種至水稻葉鞘內(nèi)（見附錄G），接種72h后觀察，出現(xiàn)典型水稻紋枯病癥狀（附錄H），將發(fā)病葉鞘采集至實驗室，重復(fù)6.2、6.3833DB2305/T040DB2305/T040—2024DB2305/T040DB2305/T040—2024附錄A水稻紋枯病田間癥狀圖A.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈4水稻紋枯病田間發(fā)病初期，葉鞘呈現(xiàn)云紋狀病斑，生育后期形成菌核。水稻紋枯病田間發(fā)病癥狀特征見圖A.1。圖A.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈4附錄B水稻紋枯病標(biāo)本特征水稻紋枯病發(fā)生于葉鞘、葉片及穗部。用于水稻紋枯病菌分離的標(biāo)本以發(fā)病莖稈為宜。水稻紋枯病發(fā)病莖稈癥狀特征見圖B.1。圖B.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈標(biāo)本圖B.1水稻紋枯病發(fā)病莖稈標(biāo)本5附錄C水稻紋枯病菌分離培養(yǎng)皿將清洗干凈并用吸水紙吸干水分的水稻紋枯病發(fā)病葉鞘樣本進(jìn)行剪切，剪成2cm×5cm的小塊，將其放入水瓊脂平板上，每個平板放置5塊病組織，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分離培養(yǎng)皿內(nèi)樣本擺放，見圖C.1。圖C.1分離培養(yǎng)皿內(nèi)樣本擺放6圖C.1分離培養(yǎng)皿內(nèi)樣本擺放6附錄D立枯絲核菌特征的菌落立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，起初白色，圖D.1為立枯絲核菌25℃培養(yǎng)36h菌落特征。D.12536h7附錄E水稻紋枯病菌的保存圖E.14℃冰箱內(nèi)保存30d的立枯絲核菌菌株P(guān)DA試管斜面8PDA154℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)?。E.14℃30d的立枯絲核菌菌株P(guān)DA試管斜面。圖E.14℃冰箱內(nèi)保存30d的立枯絲核菌菌株P(guān)DA試管斜面8附錄F立枯絲核菌形態(tài)學(xué)典型特征立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，粉狀，起初白色，后逐漸變褐色，背面變褐；不育菌5μm～d后可產(chǎn)生肉mm～2mm。見圖F.1.BBACF.1APDA5dC9附錄G(資料性)1cm1