湖庫沉積物功能微生物多樣性監(jiān)測規(guī)程（征求意見稿）

1T/ACEF0**－20**湖庫沉積物微生物多樣性監(jiān)測規(guī)程本文件規(guī)定了湖庫沉積物微生物多樣性監(jiān)測的工作程序、采樣點布設(shè)、樣本采集、轉(zhuǎn)運與保存、監(jiān)測與分析和監(jiān)測報告等。本文件適用于湖泊和水庫沉積物微生物多樣性監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB17378.7海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測GB/T32725實驗室測定微生物過程、生物量與多樣性用土壤的好氧采集、處理及貯存指南GB/T34224生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測GB/T34656海洋沉積物間隙生物調(diào)查規(guī)范GB/T39792.2生態(tài)環(huán)境損害鑒定評估技術(shù)指南環(huán)境要素第2部分：地表水和沉積物GB/T43628空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法HJ442.4近岸海域環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范第四部分近岸海域沉積物監(jiān)測HJ493樣品保存和管理技術(shù)規(guī)定HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程SN/T3509實驗室樣品管理指南3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1湖庫沉積物L(fēng)ake-reservoirsediments湖泊與水庫中由地表水體攜帶并沉于水體底部，形成底泥狀的黏土、泥沙、有機質(zhì)及礦物的混合物。3.2深水沉積物采樣器Deepwatersedimentsampler利用筒體自身重力下降至采樣位后，通過提升開閉拉繩控制閥體上升，打開筒體閥口，湖庫水底泥水界面處的水和泥進入采樣器中，松開開閉拉繩，閥體因重力作用下沉，關(guān)閉閥口，完成采樣過程的采樣器。2T/ACEF0**－20**3.3微生物Microorganism微生物是一類生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、病毒、真菌等在內(nèi)，涵蓋了有益跟有害的眾多種類。3.4微生物多樣性Microbialdiversity微生物種群多樣性，主要體現(xiàn)于微生物系統(tǒng)分類、物種數(shù)量、物種構(gòu)成等。3.5代謝指紋技術(shù)Metabolicfingerprintingtechniques基于不同底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式，測算環(huán)境樣本中微生物群落代謝功能多樣性的一種方法，可應(yīng)用BIOLOG板檢測。BIOLOG板上小孔中分別裝有不同碳源和四唑類顯色物質(zhì)，微生物群落可以利用不同種類的碳源進行代謝，以代謝過程產(chǎn)生的自由電子與四唑類顯色物質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)的吸光度差異為基礎(chǔ)，表示微生物對碳源的利用程度。4工作程序湖庫沉積物微生物多樣性工作程序宜包括采樣點布設(shè)、樣本采集、樣品保存與轉(zhuǎn)運、樣品監(jiān)測與分析，流程如圖1所示。圖1湖庫沉積物微生物多樣性工作程序5采樣點布設(shè)5.1采樣區(qū)域宜通過文獻(xiàn)調(diào)研和現(xiàn)場踏勘等方式，按研究區(qū)域概況、湖庫基本信息確定。5.2采樣區(qū)域內(nèi)，采樣點選擇應(yīng)符合下列規(guī)定：a）湖泊和水庫入口和出口，應(yīng)采集大壩岸和中間位置；b）采集樣品應(yīng)按周邊環(huán)境確定，宜采集湖泊和水庫距工廠和農(nóng)業(yè)地區(qū)較近的岸邊；c）取樣點可根據(jù)深度選擇；3T/ACEF0**－20**d）以上點位確定后，可在湖庫示意圖上稀疏的地方適當(dāng)增加點位，點位在湖庫布點宜均勻。6樣本采集樣本采樣宜符合下列規(guī)定：a）采樣前，使用防水記錄筆對無菌聚乙烯自封袋編號，對冰箱提前預(yù)冷；并檢查采樣儀器完整性；將盛放采集樣品的密封袋使用紫外燈殺毒滅菌；b）將準(zhǔn)備好的材料器材搬運到船只上，根據(jù)定位儀確定的經(jīng)緯度信息在已確定的采樣地點采樣；c）采樣的同時應(yīng)對周圍環(huán)境拍照；使用米尺測量采樣點處水深并記錄，選擇抓斗式濾水采泥器、彼得遜抓斗式采泥器、分層箱式采泥器、重力柱狀采泥器等湖庫沉積物采樣器采集沉積物，采樣器見附錄A，將采集的沉積物放進已經(jīng)標(biāo)記好的無菌聚乙烯自封袋后封存；d）對采集點照片、采樣點地點、樣品編號、采樣深度、采樣日期、采樣信息、采樣數(shù)量和水體深度記錄并保存，采樣信息登記表見附錄B。7轉(zhuǎn)運與保存7.1微生物形態(tài)學(xué)及代謝活性分析樣品轉(zhuǎn)運及儲存7.1.1分裝后的沉積物樣品，應(yīng)存放至溫度0℃的便攜式冰箱或干冰轉(zhuǎn)運。7.1.2沉積物樣品應(yīng)儲存于-20℃的低溫冰箱中。7.2微生物種群結(jié)構(gòu)樣品轉(zhuǎn)運及儲存7.2.1分裝后的樣品，應(yīng)存放至溫度0℃的便攜式冰箱或干冰轉(zhuǎn)運。7.2.2沉積物樣品應(yīng)儲存于液氮或-80℃超低溫冰箱中。8監(jiān)測與分析8.1微生物形態(tài)學(xué)分析8.1.1分析項目微生物形態(tài)特征宜包括細(xì)胞形狀、大小、顏色、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等。宜使用高分辨率顯微鏡觀察微生物細(xì)胞和胞內(nèi)含物、鞭毛或胞外結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。應(yīng)觀察不同染料標(biāo)記的微生物探針在顯微鏡下的顏色，保存不同微生物的染色圖像及其疊加圖，描述沉積物樣品中微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量以及在樣品中的相對位置。8.1.2分析流程沉積物微生物形態(tài)學(xué)分析前處理方法可參照附錄C。沉積物微生物形態(tài)學(xué)分析流程如圖2所示。將制好的樣品倒放在激光共聚焦顯微鏡4T/ACEF0**－20**載物臺上，根據(jù)標(biāo)記探針引物的特性在電腦上設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，調(diào)節(jié)焦平面，在顯微鏡下清晰觀察樣品，依次設(shè)置激光通道、物鏡放大倍數(shù)、激光強度、圖像分辨率、增益和負(fù)背景，并將結(jié)果顯示到電腦軟件上成像。觀察目鏡下微生物染色情況時，應(yīng)包括染色區(qū)域、位置以及對應(yīng)的染料，根據(jù)實驗要求可觀察一種或多種微生物分布情況，通過調(diào)節(jié)物鏡倍數(shù)還可觀察到微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)，輸出圖像。圖2沉積物微生物形態(tài)學(xué)分析流程圖8.1.3數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)處理與分析時，應(yīng)將顯微鏡觀察獲得的圖像導(dǎo)入AutoQuant圖像處理軟件，選擇sliceviewer查看共聚焦儀器軟件下的參數(shù)信息，設(shè)置不同通道參數(shù)，點擊apply，點擊3D反卷積，設(shè)置參數(shù)，選擇AdaptivePSF，然后點擊all進行校準(zhǔn)，其他應(yīng)按默認(rèn)，開始反卷積，反卷積完成，查看圖像，可進一步對每個通道圖像調(diào)整，將優(yōu)化的圖像保存為lsm格式。8.2微生物代謝活性分析8.2.1分析項目微生物代謝活性測定宜采用代謝指紋技術(shù)。8.2.2測定流程前處理前處理時，應(yīng)取濕重為1g新鮮沉積物用9mL無菌0.05M磷酸緩沖液稀釋，經(jīng)暗培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)30min后，在超凈工作臺對暗培養(yǎng)液進行梯度稀釋，隨后將稀釋后沉積物樣本轉(zhuǎn)移至滅菌水槽中，通過移液槍轉(zhuǎn)接到微生態(tài)板。5T/ACEF0**－20**代謝指紋技術(shù)測定流程代謝指紋技術(shù)測定流程如圖3所示。應(yīng)使用電子移液槍將懸浮液接種至BIOLOG板后，在暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)240h。間隔12或24h，應(yīng)用BIOLOG系統(tǒng)的微平板讀數(shù)器，測定BIOLOG板在590nm及720nm波長下的光密度值（opticaldensity，OD值），完成數(shù)據(jù)的采集、存儲與導(dǎo)出。圖3代謝指紋技術(shù)測定流程8.2.3數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)處理與分析時，應(yīng)計算BIOLOG每孔平均顏色變化率用于評估微生物碳源代謝活性，并計算香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)評估微生物群落功能豐富度及評估微生物群落功能優(yōu)勢度指數(shù)。宜采用下列公式計算：a）平均吸光度（AWCD）可表征微生物群落對碳源利用的總能力，宜采用下式計算：式中：Ai—第i孔的相對吸光度；AA1—A1孔的相對吸光度。b）Shannon指數(shù)H′用于評估微生物群落功能的豐富度，宜采用下式計算：H′=?∑Pi·ln(Pi)式中：Pi—第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率。c）Simpson指數(shù)D用于評估微生物群落功能優(yōu)勢度指數(shù)，宜采用下式計算：式中：Ai—第i孔的相對吸光度；N—相對吸光值總和。8.3微生物功能與種群結(jié)構(gòu)分析8.3.1分析項目6T/ACEF0**－20**高通量測序高通量測序時，應(yīng)識別沉積物中微生物群落組成，評估微生物種群豐富度和均勻度。宏基因測序宏基因測序時，應(yīng)解析沉積物中微生物群落豐度和群落組成，鑒定沉積物中微生物基因組成及功能、相關(guān)代謝通路。8.3.2測定流程DNA提取沉積物樣品宜開展DNA提取。DNA提取方法可參照附錄D。高通量測序高通量測序流程如圖4所示。并應(yīng)按下列步驟執(zhí)行：a）熒光定量。選擇所需功能基因條帶對提取DNA進行熒光定量qPCR分析。每個樣本重復(fù)3次。將PCR產(chǎn)物用熒光定量系統(tǒng)檢測定量，之后按每個樣本測序量要求，進行相應(yīng)比例混合。b）Illumina文庫構(gòu)建。通過PCR將Illumina接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物；Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。c）Illumina測序。以DNA片段為模版、堿基序列為引物合成目標(biāo)待測DNA片段，使芯片上DNA片段的另一端隨機與附近的另外一個引物互補形成“橋”。PCR擴增產(chǎn)生DNA簇并線性化為單鏈，加入DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)聚合的核苷酸種類。重復(fù)操作，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段序列。d）物種注釋與評估。Illumina測序得到的PEreads根據(jù)overlap關(guān)系拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。選出與OTU代表序列相似性在99%以上的序列，生成OTU表格。采用RDPclassifier貝葉斯算法對99%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并分別在分類學(xué)水平統(tǒng)計樣本的群落物種組成。圖4高通量測序流程7T/ACEF0**－20**宏基因組測序宏基因組測序流程如圖5所示。并應(yīng)按下列步驟執(zhí)行：a）基因組DNA提取與片段化。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。將基因組DNA片段化為350bp。b）構(gòu)建PE文庫。連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。c）橋式PCR。DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，固定形成“橋”；PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈。d）Illumina測序。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)聚合上去的核苷酸種類；重復(fù)操作，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。e）物種與功能注釋。數(shù)據(jù)分析從下機原始序列開始，對原始序列進行拆分、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理。然后使用優(yōu)化序列進行拼接組裝和基因預(yù)測，對得到的基因進行NR，eggNOG，KEGG等物種和功能注釋以及分類。對數(shù)據(jù)庫選擇可參照附錄E。使用DIAMOND軟件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/diamond/）將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫BLASTP比對，并通過NR數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種豐度，并在域（Domain）、界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）分類學(xué)水平上統(tǒng)計物種在樣品中的豐度，構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜（abundanceprofile）。使用DIAMOND軟件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/diamond/）將非冗余基因集序列與COG數(shù)據(jù)庫進行BLASTP比對，獲得基因?qū)?yīng)的直系同源蛋白簇（COG，Clustersoforthologousgroupsofproteins），然后使用COG對應(yīng)的基因豐度總和計算該COG的豐度。圖5宏基因組測序流程8.3.3數(shù)據(jù)處理與分析8T/ACEF0**－20**對統(tǒng)計得到的物種群落組成，宜采用喬伊（Chao1）、基于豐度的覆蓋估計值（ACE）、香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Simpson）指數(shù)反映沉積物微生物種群多樣性和豐富度。宜按下列公式計算：a）Chao1指數(shù)分析宜按下式計算：式中：Schao1—估計的物種數(shù)；Sobs—實際觀察到的物種數(shù)；n1—只含有一條序列的物種數(shù)；n2—只含有兩條序列的物種數(shù)。b）ACE指數(shù)宜用來估計群落中物種數(shù)目的指數(shù)，宜按下列公式計算：SACEACESACE其中，式中：ni—含有i條序列的物種數(shù)；Srare—含有或少于abund條序列的物種數(shù)；Sabund—多于abund條序列的物種數(shù)；abund—優(yōu)勢物種的序列數(shù)閾值，默認(rèn)10。c）Shannon指數(shù)宜用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一，與群落多樣性成正比，宜按下式計算：式中：Sobs—實際觀察到的物種數(shù)；9T/ACEF0**－20**ni—第i個物種數(shù)所含的序列數(shù)；N—所有的序列數(shù)。d）Simpson指數(shù)宜用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)，與群落多樣性成反比，宜按下式計算：式中：Sobs—實際觀察到的物種數(shù)；ni—第i個物種所包含的序列數(shù)；N—所有的序列數(shù)。T/ACEF0**－20**9監(jiān)測報告完成檢測與分析項目后，宜按表1填寫監(jiān)測報告。表1監(jiān)測報告AWCDSimpson指數(shù)優(yōu)勢物種1優(yōu)勢物種2優(yōu)勢物種3T/ACEF0**－20**附錄A（資料性）湖庫沉積物采樣器優(yōu)點：操作簡缺點：不能濾去采集到的多余的水分；只能采集表層的沉積物；對沉積物有擾2、將取樣抓斗打開，再打開的同時，將掛鉤扣3、通過繩子慢慢大獎采樣器放入水中，當(dāng)?shù)胶?、用力拉起取樣抓斗，抓斗自動關(guān)閉，在關(guān)閉的同時會將河底污泥采入取樣抓斗中；然后上提優(yōu)點：可去除采集沉積物是過多的水分；操作簡缺點：只能采集到表層的沉積物；對沉積物有端的卸扣上，用脫鉤器上的鉤勾住連桿交接件頂2、將采泥器展開放入水中，讓其自然下沉，等沉到水底，抖動繩子，讓掛鉤松開勾住的鋼絲3、雙手往上提采樣繩子，此時采泥器開口閉合，將采泥器提出水面放入備用的盆中，提起兩側(cè)的拉桿張開采泥器，倒出泥樣，用自封袋收集T/ACEF0**－20**湖庫沉積物采樣器（續(xù)）優(yōu)點：對沉積物原樣擾動??；采缺點：操作較為繁瑣，只能采取1、將繩子系在掛鉤的另一端孔，然后將掛鉤勾住兩邊的鋼絲繩，用雙手提起采泥器，此時采泥2、將采泥器展開放入水中，讓其自然下沉，等沉到水底，抖動下繩子，讓掛鉤松開勾住的鋼絲3、雙手提采樣繩子，此時采泥器活頁將關(guān)閉，將采泥器提出水面，提起兩側(cè)的鋼絲繩，把泥樣優(yōu)點：可采集多層沉積物，操作缺點：對沉積物1、當(dāng)取樣器進入水中時，透明樹脂玻璃管頂端2、柱狀采泥器可通過用手推或者自身重力插入3、當(dāng)采到所需的樣品時，將取樣器從沉積物中取出，在上升過程中，取樣器頂端的閥門會由于水壓的作用而關(guān)閉。向上移動產(chǎn)生一個真空作4、當(dāng)取樣器從水中取出后，通過一個活塞將樣T/ACEF0**－20**湖庫沉積物采樣器（續(xù)）優(yōu)點：可根據(jù)需求采集不同深度的沉積物，對沉積物的擾動比較缺點：操作較為T/ACEF0**－20**（資料性）湖庫沉積物采樣信息登記表采樣湖庫名稱：采樣日期：采T/ACEF0**－20**（資料性）沉積物微生物形態(tài)學(xué)分析前處理方法1.將載玻片置于鹽酸乙醇溶液中浸泡清洗30min，取出在空氣中晾干；2.將晾干后的載玻片放入0.01%的多聚賴氨酸溶液中浸泡5min，取出后放入60℃的烘箱烘干或者室溫過夜晾干，這一步會使載玻片表面帶有正電荷的賴氨酸涂層；3.定量吸取1mL飽和含氧水孵育15天之后的表層2cm新鮮的湖庫沉積物，加入3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液，輕輕混勻后置于4℃冰箱固定3h以上或者過夜；4.多聚甲醛固定之后將樣本在6000r/min的條件下離心2min，移去上清液；5.加入3mL磷酸鹽緩沖溶液(1xPBS)重懸沉積物，在6000g的條件下離心2min，移去上清液，此步重復(fù)操作3次以盡量洗去多余的多聚甲醛溶液；6.加入1mL無水乙醇/1xPBS(v/v=1:1)混合溶液重懸沉積物，隨后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?.取3μL固定后沉積物樣品涂在預(yù)處理后的載玻片上并展開，在46℃烘箱烘干使得樣本粘附在載玻片上；8.隨后將附著有樣本的載玻片依次浸入50%、80%、96%的乙醇溶液，每個梯度浸沒3min，最后于空氣中自然晾干；9.將探針用無菌水配置成濃度為10μmol/L并分裝，F(xiàn)ISH雜交前取分裝好的探針溶液與FISH雜交緩沖液按體積比1:9混合，使得探針的終濃度為1μmol/L，用錫箔紙包好放入46℃水浴鍋中預(yù)熱數(shù)分鐘；10.將預(yù)熱后的探針完全覆蓋載玻片上的樣本，并將載玻片迅速轉(zhuǎn)移到雜交管，在46℃下雜交2-3小時（黑暗潮濕中進行）；11.提前將FISH洗脫緩沖液預(yù)熱到48℃;12.待FISH雜交完成后，將載玻片快速放入48℃預(yù)熱后的洗脫緩沖液中，放入48℃黑暗恒溫烘箱中洗脫30min。最后在暗處用4℃超純水洗掉載玻片上多余鹽分，并自然風(fēng)干；13.將上一步風(fēng)干后的載玻片用DAPI覆蓋樣本，在4℃暗處染色15min，染色結(jié)束后用4℃超純水洗掉多余的DAPI，暗室自然風(fēng)干；14.待樣本自然風(fēng)干后，用適量封片劑覆蓋樣本并蓋上蓋玻片。最后使用激光共聚焦顯微鏡成像觀察。T/ACEF0**－20**（資料性）沉積物DNA提取方法自備儀器和材料：水浴鍋、小型高速離心機（最大離心力不小于12,000×g）、1.5mL離心管、75%乙醇、無水乙醇、RNaseA(10mg/mL)、氯仿等。1.稱取100~300mg的土壤，加入400μL65℃預(yù)熱的BufferSCL，震蕩混勻，置于65℃水浴5min。注：每次使用前請檢查BufferSCL是否出現(xiàn)沉淀，如有沉淀，于65℃溶解后使用。提前將水浴鍋調(diào)至65℃?zhèn)溆谩Ｕ鹗幓靹驎r一定要將管底的土壤震蕩起來。樣品較多時可適當(dāng)延長水浴時間。如需得到無RNA的DNA，可在水浴后加入20μL的RNaseA（10mg/mL），室溫放置2~5min。2.12,000rpm室溫離心3min。吸取上清至一個干凈的1.5mL的離心管中。3.加入等體積BufferSP，顛倒混勻，冰浴10min。4.12,000rpm室溫離心3min。吸取上清至一個干凈的1.5mL的離心管中。5.加入200μL氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min。吸取上層水相至一個干凈的1.5mL的離心管中。6.加入2倍體積無水乙醇，顛倒5~8次使之充分混勻，室溫放置2~3min。室溫10000rpm離心5min，棄上清。7.加入1mL75%乙醇，顛倒漂洗1~3min，10,000rpm離心2min，棄上清。8.重復(fù)步驟7一次。9.開蓋室溫倒置5~10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。10.得到的DNA用50~100μLTEBuffer（TEBuffer為10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0）溶解。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-80℃保存。T/ACEF0**－20**（資料性）微生物種群及功能注釋對