X版藥典微生物

X版藥典微生物2010年版藥典附錄無菌檢查和微生物

限度檢查方法增修定內(nèi)容新增微生物限度檢查法指導(dǎo)原則一、抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則二、藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則三、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則四、藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則一：藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則⒈目的該指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗實驗室的質(zhì)量控制。⒉藥品微生物的檢驗的對象具特殊性；活的生物、分布不均勻、重現(xiàn)性差必須使用經(jīng)驗證的檢測方法并嚴(yán)格按照藥品微生物實驗室規(guī)范要求進行試驗影響試驗結(jié)果的因素1人員2設(shè)施與環(huán)境3檢驗的標(biāo)準(zhǔn)與方法4設(shè)備5測量的溯源性抽樣6樣品的處理7檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的控制8檢驗報告⒊藥品微生物實驗室規(guī)范包括以下幾個方面人員、培養(yǎng)基、菌種、實驗室的布局和運行、設(shè)備、文件、實驗記錄、結(jié)果的判斷等人的要求1：人是質(zhì)量控制與管理的主體2：2010年版無菌檢查法增加了對進行無菌檢查人員的要求：必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。3;考試上崗問題;檢驗人員經(jīng)過考試（理論與操作考試），經(jīng)過技術(shù)負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)取得上崗證方可從事藥品微生物學(xué)檢驗培訓(xùn)內(nèi)容1上崗前指導(dǎo)性培訓(xùn)：生物安全操作知識和消毒知識，衛(wèi)生要求，潔凈區(qū)的使用，保潔與檢測等。2上崗培訓(xùn)：各種有關(guān)微生物的操作技術(shù)（無菌，微生物限度，效價），與各種檢驗標(biāo)準(zhǔn)知識，設(shè)施，設(shè)備的使用3繼續(xù)教育提高培訓(xùn)：新知識，新儀器新技術(shù)的使用，國際國內(nèi)先進的微生物學(xué)檢驗專業(yè)知識。4質(zhì)量觀念的培訓(xùn)：實驗室的質(zhì)量目標(biāo)，相關(guān)計量知識的學(xué)習(xí)

⒉培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是微生物試驗的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗結(jié)果。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。該指導(dǎo)原則對培養(yǎng)基的制備、儲存、滅菌及質(zhì)量控制進行了指導(dǎo)。培養(yǎng)基必須具備五個條件:1含有細菌生長所需的物質(zhì)：如：水分、養(yǎng)分（氮源、碳源、礦物質(zhì)）2適宜的酸堿性：多數(shù)為pH7.2-7.6，有的為pH5.6-6.8（最常用的溶劑為純化水特殊情況下用去離子水或者蒸餾水）3不含抑制細菌生長的物質(zhì)4均質(zhì)透明：便于觀察細菌生長性狀和引起培養(yǎng)基的變化5嚴(yán)格滅菌，保證無菌。（按生產(chǎn)者提供或者使用者驗證的參數(shù)滅菌）

⒊菌種

實驗室菌種的處理和保藏的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，⑴使盡可能減少菌種污染和生長特性的改變。⑵按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗結(jié)果一致性的重要保證。該指導(dǎo)原則對菌種的來源、菌種保藏、菌種的傳代和使用、菌種的管理進行了詳細的說明和指導(dǎo)。菌種代號的意義國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種代號是

CMCC（F）或CMCC（B）

CMCC——中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

B——代表細菌,F——代表真菌。

大腸桿菌[CMCC(B)44102]

乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

２、菌種保藏的原則菌種保藏的原理

微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。

３、菌種的傳代和使用

⑴工作菌種的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代防止過度的傳代造成菌種變異,工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株.⑵任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。實驗室應(yīng)對工作菌株的特性和純度進行確認(rèn)。標(biāo)準(zhǔn)菌株一般是從菌種保藏中心或?qū)I(yè)實驗室購買得到的，用符號S表示。一般可保存5年。

按菌種保藏中心的要求進行恢復(fù)培養(yǎng)。中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)建議的方法如下：

①安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰將安瓿管頂端加熱，滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

②菌株恢復(fù)培養(yǎng)：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯），滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，取約0.2ml菌體懸浮液，移植于指定的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)（3-4ml），然后在建議的溫度下（一般培養(yǎng)溫度32.5℃±2.5℃，18～24h）培養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株⑴標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株.冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后,不得重新冷凍或再次使用。采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法，用于菌種的傳代，。甘油冷凍管保藏法一般可保存2年；

甘油冷凍管保存法甘油冷凍管保存法適用于保存?zhèn)鞔镁N，一般可保存2年。

①將待保存用菌種接種至平板或瓊脂斜面，經(jīng)37℃24～48h培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)輕輕刮

取菌苔，移至預(yù)先裝有無菌蒸餾水的試管中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于1單位麥?zhǔn)媳葷峁堋?/p>

②向已制備好的菌懸液中加入等體積，濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。

③輕輕振搖，使10%甘油菌懸液充分混合，分裝于無菌小試管中，在-30℃條件下貯存。

工作菌種：工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株保存于半固體內(nèi)或瓊脂斜面培養(yǎng)基中，作為工作用菌種，用符號W表示。一般可保存1～2個月。嚴(yán)格控制傳代次數(shù)，工作菌種不超過五代，凍干菌種→營養(yǎng)肉湯→半固體瓊脂或甘油水100支冰箱保存

（原代）（一代）（二代）⒋菌種的管理

嚴(yán)格的程序化管理實驗室必須建立菌種保存和使用文件的程序管理制度菌種的銷毀

1方法：菌種銷毀采用高壓蒸汽滅菌：121℃，20分鐘。

2需及時銷毀處理菌種：①發(fā)生污染或變異的菌種；②超過保存期限的菌種；③使用后的菌種。

⒌實驗室的布局和運行

⑴實驗室布局設(shè)計的基本原則①具有檢測所需的適宜、充分的設(shè)施條件。②合理的布局與設(shè)計，具有獨立的實驗室、輔助區(qū)域各區(qū)域應(yīng)有明確標(biāo)識。③建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

⒍建立合理的控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

⑴對進出潔凈區(qū)域的人和物建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。⑵消毒劑的配制應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配制，對所用的消毒劑種類應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無菌。

⑶建立檢樣品傳遞、儲存、處置和識別管理程序。⑷建立帶菌培養(yǎng)物溢出的意外事件制定處理規(guī)程。⑸建立合理的取樣控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

⒎設(shè)備實驗室應(yīng)配備與檢驗?zāi)芰凸ぷ髁肯噙m應(yīng)的儀器設(shè)備，其類型、測量范圍和準(zhǔn)確度等級應(yīng)滿足檢驗所采用標(biāo)準(zhǔn)的要求，設(shè)備的安裝和布局應(yīng)便于操作，易于維護、清潔和校準(zhǔn)。使用的消毒劑應(yīng)無菌。建立相應(yīng)的操作和維護和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

⒏文件

文件應(yīng)當(dāng)充分表明試驗是在實驗室里按可控的檢查法進行的，一般包括以下方面：質(zhì)量管理文件、程序文件、技術(shù)操作文件。

⒐實驗記錄的保存

實驗結(jié)果可靠性的依賴于試驗嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行，包括正確的試驗操作、實驗記錄、(所有關(guān)鍵的實驗細節(jié))，以便確認(rèn)數(shù)據(jù)的完整性。

⒑結(jié)果的判斷

由于微生物試驗的特殊性，在實驗結(jié)果分析時，應(yīng)從各個可能的方面去考慮，不但要假設(shè)被污染，而且要考