第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法顯微鏡和顯微鏡的分辨能力:肉眼：0.2mm;光鏡：0.2um;電鏡：0.2nm第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離λ:

光源波長(zhǎng);α:物鏡鏡口角;N:介質(zhì)折射率第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理

應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope） 偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法雙目顯微鏡第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法正置顯微鏡倒置顯微鏡第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡及其照片第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法共聚焦顯微鏡及其顯微圖像第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法激光共聚焦原理第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法暗視野成像原理第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)

冰凍蝕刻技術(shù)

超薄切片技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電鏡種類掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡光路圖比較第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電子顯微鏡的基本構(gòu)造第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法主要電鏡制樣技術(shù)

超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)

冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）

電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法透射電鏡及其圖像第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡

原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡及其圖像第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、掃描遂道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。 （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法差速離心:分離密度不同的細(xì)胞組分密度梯度離心:精細(xì)組分或生物大分子的分離第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

DNA：福爾根（Feulgen）反應(yīng)－－紫紅色多糖類：PAS反應(yīng)－－黃色脂肪：蘇丹III－－紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon）－－紅色第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

免疫電鏡技術(shù)：

免疫鐵蛋白技術(shù)

免疫酶標(biāo)技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法原位雜交技術(shù)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法五、放射自顯影技術(shù)

原理及應(yīng)用：

利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；

實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。

步驟：

前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：

紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）

主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞術(shù)第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、細(xì)胞的培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)1，動(dòng)物細(xì)胞:

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制

細(xì)胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失2，植物細(xì)胞

（單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細(xì)胞培養(yǎng)）

3，非細(xì)胞體系

（DNA復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡運(yùn)輸，細(xì)胞核裝配等）

細(xì)胞提取物，細(xì)胞核提取物第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的克隆第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

二、細(xì)胞工程

細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)

單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)

細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)

物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)

化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)

制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術(shù)

遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展