第十三章-可見分光光度法和紫外分光光度法

第十三章可見分光光度法和紫外分光光度法第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜第二節(jié)分光光度法基本原理第三節(jié)可見分光光度法

分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對物質(zhì)進行定性、定量分析的一種方法。根據(jù)測定時所用的光源波長的不同，分光光度法可分為可見分光光度法、紫外分光光度法和紅外分光光度法等幾種，本章著重介紹可見分光光度法。與滴定分析方法相比，分光光度法是靈敏度高、被測物質(zhì)濃度的下限可達10－5至10－6mol·L-1，因而適用于微量及痕量成分的測定，是當(dāng)前醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保、化工等部門常用的分析方法之一。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收二、物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收

當(dāng)一束光照射在某物質(zhì)或某溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子等粒子與光子作用，光子的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，使低能量軌道躍遷到高能量軌道，即由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，這個過程即是物質(zhì)對光的吸收。M（基態(tài)）＋h?M*（激發(fā)態(tài)）

不同物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差不同，選擇吸收光子的能量也不同，即吸收的波長不同。光的能量與波長成反比，波長越短，能量越高。

單一波長的光稱為單色光，由不同波長組成的光稱為復(fù)色光。白光（日光等）就是一種復(fù)色光，它是由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色的光按一定的強度比例混合而成。若兩種顏色的光按照適當(dāng)?shù)膹姸缺壤旌峡沙砂坠猓瑒t這兩種光稱為互補色光。處于同一直線上的兩種色光為互補光，見下圖：從圖中可以看到，藍光與黃光互補，青光與紅光互補等物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色吸收光顏色波長范圍（nm)黃綠紫380－435黃藍435－480橙黃綠藍480－500紅紫綠500－560紫黃綠560－580藍黃580－595綠藍橙595－650藍綠紅650－760

物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補光。

如CuSO4溶液選擇性地吸收白光中間的黃色光，故CuSO4溶液呈藍色。

[Fe(SCN)6]3-呈血紅色，說明其溶液選擇性地吸收白光中的青色光。如果溶液不吸收白色光，則溶液表現(xiàn)為無色透明；如溶液對所有顏色的光全部吸收，則溶液呈黑色。二、物質(zhì)的吸收光譜吸光度（A）：測量溶液對不同波長的單色光的吸收程度。吸收曲線（或吸收光譜）：以波長為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，可得一曲線，此曲線就是吸收曲線（或吸收光譜）以三（鄰二氮菲）合鐵（II）離子的吸收光譜圖為例，看看它的吸收光譜：（1）、（2）（3）、（4）的濃度逐漸增大從吸收光譜圖中看出，不同濃度的吸收光譜，形狀基本一致，最大吸收波長都相同；還可以看到溶液濃度不同，吸收光譜的峰值越高，兩者成正比關(guān)系。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。吸收光譜體現(xiàn)了物質(zhì)的特性，是進行定性、定量分析的基礎(chǔ)。是定性分析的依據(jù)，溶液濃度越大，則吸光度A越大，是進行定量分析的依據(jù)。第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度二、Lambert-Beer定律三偏離Lambert-Beer定律的原因一、透光率和吸光度當(dāng)一束單色光通過均勻的溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，還有一部分被器皿表面反射。設(shè)入射光強度為I0,吸收光強度為，透射光強度為It，反射光強度為Ir，則：

在分光光度法中，通常將被測溶液和參比溶液分別置于兩個材料和厚度的吸收池中，因此上式可簡化為：透射光的強度It與入射光強度I0之比稱為透光率，用T表示：透光率越大，溶液對光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液對光的吸收越多。透光率的負對數(shù)稱為吸光度，用A表示。A越大，溶液對光的吸收越多。

二、Lambert-Beer定律(1)Lambert定律適用條件：對所有的均勻介質(zhì)(即低濃度溶液）都適用測定條件：在濃度一定的條件下關(guān)系式為：

b:液層厚度；k1：比例系數(shù)，它與被測物質(zhì)的性質(zhì)、入射光的波長、溶劑、溶液濃度及溫度有關(guān)。（2）Beer定律適用條件：僅適用于單色光測定條件：在液層厚度一定的條件下關(guān)系式為：A=k2Cc:物質(zhì)的量濃度；k2：它與被測物質(zhì)的性質(zhì)、入射光的波長、溶劑、液層厚度及溫度有關(guān)。等有關(guān)的常數(shù)。（3）Lambert-Beer定律當(dāng)一適當(dāng)波長的單色光通過溶液時，若液層厚度一定，則吸光度與溶液濃度成正比，并且與吸光物質(zhì)種類、溶劑、入射光波長、液層厚度和溶液溫度有關(guān)，且對所有的均勻介質(zhì)（即低濃度溶液）和單色光都適用。

b的單位為cm,c為物質(zhì)的量濃度（mol·L-1），ε為摩爾吸光系數(shù)，單位為L·mol-1·cm-1。

若用質(zhì)量濃度代替物質(zhì)的量濃度c，則Lambert-Beer定律可表示為：式中為質(zhì)量吸光系數(shù)，單位為L·g-1·cm-1

和可通過下式轉(zhuǎn)換：表示被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。或是通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀溶液測得的，它的數(shù)值越大，表明溶液對入射光越容易吸收，測定的靈敏度就越高。一般值大于103即可進行分光光度法測定。由Lambert-Beer定律可知：如果溶液中存在兩種或兩種以上對光有吸收的物質(zhì)，在同一波長下只要共存物質(zhì)不互相影響，即不因共存物的存在而改變本身的吸光系數(shù)，則吸光度是各共存物質(zhì)吸光度之和，即：式中A為總吸光度，Aa、Ab、Ac…..為溶液中共存物質(zhì)各組分a、b、c……等的吸光度。例：已知某化合物的相對分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配制成濃度為0.150mmol·L－1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8％，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε及質(zhì)量吸光系數(shù)。解：由Lambert-Beer定律可得已知c=0.150×10-3mol·L－1，b=2.00cm，T=0.398代入三偏離Lambert-Beer定律的原因根據(jù)Lambert-Beer定律，以A為縱坐標(biāo)，以cB或ρB為橫坐標(biāo)作圖，應(yīng)得到一條通過原點的直線。但在實際測定中，常會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線的現(xiàn)象，曲線向上或向下發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象稱為偏離Lambert-Beer定律。標(biāo)準(zhǔn)曲線的偏離引起偏離Lambert-Beer定律的原因有物理因素和化學(xué)因素兩大類。（一）物理因素引起的偏離1.非單色光引起的偏離假設(shè)入射光僅由波長為

和的兩種單色光組成，其強度分別為I01和I02，當(dāng)通過濃度為cB，厚度為d的吸光物質(zhì)溶液后，透射光的強度分別為I1和I2。對波長為的單色光：對波長為的單色光：實際測定時，只能測得它們的總吸光度A總。由于總?cè)肷涔鈴姸葹镮01＋I02，總透射光強度為I1＋I2，故：若，則有：

即總吸光度A總與濃度cB仍服從

Lambert-Beer定律。此結(jié)論可能對應(yīng)以下兩種不同的情況：（1）很小，可近似認為，入射光近似為單色光，故A與cB仍成正比。（2）盡管較大，但在所選擇的入射光波長范圍附近吸收曲線較平坦，因此κ變化較小，故

A與cB仍保持較好的線性關(guān)系。若較大時，不等于，則A與cB

不成正比而偏離Lambert-Beer定律，與相差越大，偏離就越顯著。2.非平行入射光引起的偏離若入射光束為非平行光，就不能保證光束全部垂直通過吸收池，可能導(dǎo)致光束通過吸收池的實際平均光程大于吸收池的厚度，使實際測得的吸光度大于理論值，從而導(dǎo)致與Beer定律產(chǎn)生正偏離。

3.介質(zhì)不均勻引起的偏離若溶液中生成溶膠或發(fā)生渾濁，當(dāng)入射光通過該溶液時，除一部分被吸光物質(zhì)吸收外，還有一部分被溶膠粒子和粗分散粒子散射而損失，使透光率減小，實測的吸光度偏高，從而對Lambert-Beer定律產(chǎn)生正偏離。1.溶液濃度過高引起的偏離若吸光物質(zhì)溶液的濃度較高時，吸光粒子之間的相互作用較強，改變了吸光粒子對光的吸收能力，使溶液的吸光度與溶液濃度之間的線性關(guān)系發(fā)生了偏離。2.化學(xué)反應(yīng)引起的偏離

Lambert-Beer定律中的濃度是指吸光物質(zhì)的平衡濃度，而在實際工作中常用吸光物質(zhì)的分析濃度來代替。當(dāng)吸光物質(zhì)的平衡濃度等于其分析濃度或與分析濃度成正比時，A與cB的關(guān)系服從Lambert-Beer定律。（二）化學(xué)因素引起的偏離

被測吸光物質(zhì)在溶液中常發(fā)生締合、解離、互變異構(gòu)、逐級配位等反應(yīng)，形成新的化合物而改變了其平衡濃度與分析濃度之間的正比關(guān)系，從而導(dǎo)致偏離Lambert-Beer定律。第三節(jié)

可見分光光度法一、分光光度計二、測定方法三、吸光光度法分析條件的選擇四、應(yīng)用-鐵的測定一、分光光度計光源單色光器檢測器吸收池

訊號處理及顯示器1、光源

可見分光光度法是以鎢燈作光源。鎢燈可發(fā)出320至3200nm的連續(xù)光譜，波長最適宜的波長范圍為360至1000nm。2、單色光器單色光器由棱鏡或光柵、狹縫和準(zhǔn)直鏡等部分組成。通過轉(zhuǎn)動棱鏡便可在出光狹縫得到所需波長的單色光。

所以混合光從空氣進入棱鏡后，便按波長由長到短的順序依次分散成為一個連續(xù)光源。單色光器的作用就是將混合光分散成一系列的單色光。3、吸收池

分光光度計中用來盛放溶液的容器稱為吸收池，是用光學(xué)玻璃制成。在測定中同時配套使用的吸收池應(yīng)相匹配，即有相同的厚度和相同的透光性。4、檢測器可見分光光度計中的檢測器一般用光電管，它是用一個陽極和一個對光敏感材料制成的陰極所組成的真空二級管，當(dāng)光照射到陰極時，表面金屬發(fā)射電子，流向電勢較高的陽極而產(chǎn)生電流。光電管輸出的電訊號很弱，約為1×10－6A，經(jīng)放大器放大后輸入指示器。指示器一般有微安電表，記錄器，數(shù)字顯示和打印等。透光率刻度是等分的，因吸光度與透光率是負對數(shù)關(guān)系，所以吸光度刻度是不均等的。二、測定方法（一）、標(biāo)準(zhǔn)曲線法（二）、標(biāo)準(zhǔn)對照法（一）、標(biāo)準(zhǔn)曲線法方法是：取標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長處（通常為），用同樣厚度的吸收池分別測定其吸光度，作圖，得一通過坐標(biāo)原點的直線——標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將被測溶液置于吸收池中，在相同條件下，測量其吸光度，根據(jù)吸光度即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其對應(yīng)的含量。使用時要注意標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液在相同條件下進行測量，且溶液的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。00.20.40.60.811.2050100150200Aρ/(mg·L-1)

維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（二）標(biāo)準(zhǔn)對照法先配制一個與被測溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液（其濃度用Cs表示），在處測出吸光度，在相同條件下測出試樣溶液的吸光度，則試樣溶液濃度可按照下試求得：此法適用于非經(jīng)常性的分析工作。三、吸光光度法分析條件的選擇（一）、顯色反應(yīng)及其條件（二）、測定波長的選擇（三）、吸光度范圍的選擇（四）、參比溶液的選擇1、顯色反應(yīng)及其條件可見光區(qū)的吸光光度法只能用于測定有色溶液。對無色溶液和顏色較淺的溶液進行測定時，必須加入一種能與被測組分反應(yīng)生成顏色較深的有色化合物的試劑，然后再進行測定。將被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)稱為

顯色反應(yīng)，能與被測組分反應(yīng)使之生成有色化合物的試劑稱為顯色劑。

顯色劑必須滿足下述條件：

（1）靈敏度要高：可見吸光光度法一般用于微量組分的測定，因此要求選擇的顯色劑能與待測組分生成摩爾吸收系數(shù)較大的有色化合物。生成的有色化合物的摩爾吸收系數(shù)越大，對入射光的吸收程度越大，測定的靈敏度就越高。（2）選擇性要好：選用的顯色劑最好只與待測組分發(fā)生顯色反應(yīng)，而與溶液中共存的其他干擾離子不顯色，或者顯色劑與被測組分所生成的有色化合物的顏色和顯色劑與干擾離子所生成有色化合物的顏色有明顯的不同。

（3）顯色劑與被測組分生成的有色化合物要有足夠的穩(wěn)定性，不易受外界條件的影響而發(fā)生變化。（4）顯色劑與被測組分生成的有色化合物的組成要恒定，符合一定的化學(xué)式，否則測定的再現(xiàn)性就較差。（5）有色化合物與顯色劑的最大吸收波長的差別要足夠大，一般要求相差60nm以上。2、顯色條件的選擇

（1）.顯色劑的用量顯色劑的適宜用量常通過實驗確定，其方法是取7~10個相同濃度的被測組分的溶液，并固定其他條件，然后分別在溶液中加入不同量的顯色劑，逐一測定吸光度，繪制吸光度A與顯色劑濃度cB

的關(guān)系曲線。吸光度與顯色劑用量的關(guān)系

（2）.溶液的酸度溶液的酸度對顯色反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在以下三個方面：①溶液的酸度對被測組分存在狀態(tài)的影響：大多數(shù)被測金屬離子易水解，當(dāng)溶液pH增大時，可能生成各種類型的氫氧基配合物，甚至生成氫氧化物沉淀，使顯色反應(yīng)不能進行完全。

②溶液的酸度對顯色劑的平衡濃度和顏色的影響：大多數(shù)顯色劑是有機弱酸或有機弱堿，當(dāng)溶液的pH變化時，將影響顯色劑的平衡濃度，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。另外，有一些顯色劑本身就是酸堿指示劑，它們在不同pH的溶液中具有不同的結(jié)構(gòu)，而產(chǎn)生不同的顏色，所以對顯色反應(yīng)也有影響。

③溶液酸度對有色化合物組成的影響：在不同pH的溶液中，顯色劑與待測離子形成的有色化合物的組成往往不同，其顏色也不同。必須控制合適的pH，才能獲得好的分析結(jié)果。

不同的顯色反應(yīng)的適宜pH是通過實驗確定的。具體方法是:固定溶液中被測組分和顯色劑的濃度，改變濃度的pH，測定此pH下溶液的吸光度，以pH為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作出pH與吸光度的關(guān)系曲線，從中可找出適宜的pH范圍。pH與吸光度的關(guān)系曲線

(3).顯色溫度顯色反應(yīng)一般在室溫下進行，但有些顯色反應(yīng)需要加熱到一定溫度時才能完成，而有些化合物當(dāng)溫度較高時又容易發(fā)生分解。對不同的顯色反應(yīng)，應(yīng)通過實驗找出各自的最佳溫度范圍。(4).顯色時間通過實驗來確定合適的測定時間。實驗的方法是配制一份待測溶液，從加入顯色劑起計算時間，每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制A-t關(guān)系曲線，根據(jù)曲線選擇合適的測定時間。（二）、測定波長的選擇選擇溶液具有最大吸收的波長λmax作為入射波長。在λmax處最大，使測定具有較高的靈敏度；同時，在λmax處的一個較小范圍內(nèi)，吸光度變化較小，不會偏離Lambert-Beer定律，也使測定具有較高的準(zhǔn)確度。如果干擾物質(zhì)在λmax處也有強烈吸收時，可選用非最大吸收處的波長，但應(yīng)盡可能選擇隨波長改變而變化不大的區(qū)域內(nèi)的波長。（三）、吸光度范圍的選擇

在吸光光度分析中，分光光度計的讀數(shù)誤差也是測定誤差的主要來源之一。對于同一臺儀器，透光率讀數(shù)的絕對誤差基本上為一定值。由于透光率T與試樣溶液濃度cB

之間為對數(shù)關(guān)系，因而在不同的透光率讀數(shù)范圍內(nèi)，這一恒定誤差所引起的濃度cB

的測定的相對誤差是不同的。

以上兩式相除：上式也可改寫成：

根據(jù)Lambert-Beer定律：當(dāng)液層厚度d為定值時，將上式微分：不同透光率時測定濃度的相對誤差ΔcB/cB(ΔT=0.01)T/%95908070605036.83020105220.610.75.64.03.32.92.72.83.24.36.513.0測定相對誤差與透光率的關(guān)系

在T=36.8%（A=0.434）時，濃度測定的相對誤差最小。在實際測定時，常將吸光度控制在0.2~0.7（T=20%~65%）之間，以減小濃度測定的相對誤差。（四）、參比