生物技術(shù)制藥-基因工程

基因工程制藥第二章基因工程制藥第一節(jié)基礎(chǔ)知識(shí)第二節(jié)基因工程制藥的基本方法第一節(jié)基礎(chǔ)知識(shí)1.細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（真核和原核）真核細(xì)胞原核細(xì)胞細(xì)胞大小非細(xì)胞生命體2.細(xì)胞核中的染色體染色體

chromosomeDNA長度:4.6x107

bp=1.5cmChromosome長度:2μm壓縮率=8000130nm纖維30nm染色質(zhì)纖維5壓縮率=50H1H1H1H1H1H1消化時(shí)間MononucleosomeChromatosomeCoreParticleLinkerDNA(variable)染色體的解剖Chromatin4DNA組蛋白組蛋白3.DNAhelical10layerLinesBetweenCrossPatterns(10ResiduesPerturn)堿基互補(bǔ)：A/TC/GABZ手性Handedness螺距PitchBaseInclination12DNA半保留復(fù)制4.基因組任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為genomes（基因組）。幾種生物的基因組比較病毒SV40

5.2

1

環(huán)狀大腸桿菌40001環(huán)狀酵母17×17000

17

線狀人23×5-7×10623線狀種類大小（Kb）

染色體數(shù)形狀5.基因DNA上具有特定功能的一個(gè)片斷，負(fù)責(zé)一種特定性狀的表達(dá)。一般來講，一個(gè)基因只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)。DNA上的基因6.DNA、RNA與蛋白質(zhì)DNA:兩條互補(bǔ)鏈。由ATCG四個(gè)字母（堿基）形成的字符串。RNA:單鏈結(jié)構(gòu)。由AUCG四個(gè)字母（堿基）形成的字符串。蛋白質(zhì):一條或多條肽鏈。每個(gè)肽鏈?zhǔn)怯?0種氨基酸形成的長鏈，即20個(gè)字母（氨基酸）形成的字符串。翻譯：每3個(gè)堿基翻譯成一個(gè)氨基酸。中心法則DNARNA蛋白質(zhì)DNA轉(zhuǎn)錄翻譯反轉(zhuǎn)錄復(fù)制7.電泳在凝膠一端小槽中放入熒光標(biāo)記的DNA片斷，兩端加電壓，短DNA片斷跑得快，長DNA片斷跑得慢。測序時(shí)需要區(qū)分長度只差一個(gè)堿基的片斷8.PCRDNA體外擴(kuò)增方法的一種，能夠?qū)⒑苌俚脑嚇樱ū热缰挥凶锓傅囊坏窝?，擴(kuò)增成完全相同的無數(shù)拷貝。每PCR一輪，擴(kuò)增兩倍1-2-4-8-16…

PCR（polymerasechainreaction，

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎(jiǎng)，Mullis是其中之一Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA，……

PCR技術(shù)的發(fā)明Mullis教授開汽車時(shí)的聯(lián)想逶迤崎嶇的山路——DNA雙螺旋1988年發(fā)明了PCR技術(shù)1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)行駛的汽車——一小段DNA引物Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。PCR的發(fā)展史1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)；1983年12月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49bp長度的第一個(gè)PCR片斷；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒；1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202

），這回Mullis是第一發(fā)明人。1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法；1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，這是85年春天Mullis建議做的；1988年，第一臺(tái)PCR儀問世；1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合復(fù)制延伸：以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個(gè)基因片段PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時(shí)PCR的應(yīng)用領(lǐng)域:生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）耐高溫DNA聚合酶的種類TaqDNA聚合酶

(Thermus

aquaticus，Cetus/Roche)TthDNA聚合酶(Thermus

thermophilus，Toyobo)Pfu

DNA聚合酶

（Pyrococcus

furiosus，Stratagene）Deep

VentDNA聚合酶(Bio-labs）

Tfl

DNA聚合酶（Thermus

flavus，Promega)Tli

DNA聚合酶(Thermococcus

litoralis，Promega)VentDNA聚合酶(Bio-labs）

PwoDNA聚合酶

(Pyrococcus

woesei，Roche)PfxDNA聚合酶

(Thermococcus

kodakaraensis,Invitrogen)DynazymeDNA聚合酶（Thermus

brockianus，F(xiàn)innazyme）FDDNA聚合酶

(Thermus

sterophilus？，復(fù)旦大學(xué))Tma,Tne,KOD,……9.DNA測序確定一條染色體片斷上的堿基順序。Sanger法：在PCR時(shí)加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個(gè)作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1974年的Nobel獎(jiǎng)Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第二步：熒光檢測全自動(dòng)的測序儀器：MegaBace已完成測序工作的生物面包酵母線蟲果蠅擬南芥2002年中國科學(xué)家公布水稻基因組ADraftSeque