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文檔簡介
免疫學技術專題知識免疫學技術專題知識第1頁經(jīng)典免疫學方法:一、凝集反應(agglutination)細菌、紅細胞等顆粒性抗原與對應抗體結合后形成凝集團塊反應。1、直接凝集反應2、間接凝集反應3.間接凝集抑制反應免疫學技術專題知識第2頁免疫學技術專題知識第3頁二、沉淀反應(precipitation)血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與對應抗體結合后出現(xiàn)沉淀物反應。1、單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)2、雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)3、免疫電泳(immunoelectrophoresis)4、火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis)5.免疫濁度測定(immunonephelometry)免疫學技術專題知識第4頁免疫學技術專題知識第5頁免疫學技術專題知識第6頁免疫學技術專題知識第7頁免疫學技術專題知識第8頁免疫學技術專題知識第9頁免疫濁度測定:可溶性Ag+Ab,二者百分比適當時,在特殊緩沖液中快速形成一定AgAb復合物,使反應液出現(xiàn)濁度。透射比濁法散射比濁法速率散射比濁法終點散射比濁法免疫學技術專題知識第10頁免疫學技術專題知識第11頁一定要保持抗體過量,以維持抗原-抗體復合物相對不溶解性。免疫學技術專題知識第12頁該方法分析范圍主要檢測是血漿、體液中特定蛋白系列。如Ig、補體、血漿蛋白、炎性反應蛋白、一些小分子量治療性藥品濃度等。免疫學技術專題知識第13頁第一節(jié)
免疫學檢測常見標識技術免疫學技術專題知識第14頁免疫標識技術(immunolabellingtechnique)指用熒光素、放射性核素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(膠體金、鐵蛋白)作為示蹤劑標記抗體或抗原進行抗原—抗體反應。優(yōu)點:高靈敏度、特異性、快速,能定性、定量、定位測定,易于觀察結果并適合自動化檢測??傮w分為:免疫組化:定位檢測組織或細胞中Ag/Ab免疫測定:定量檢測液體標本中Ag/Ab也可分為:熒光免疫技術,放射免疫技術,酶免疫技術,化學發(fā)光免疫技術及免疫金標識技術等。免疫學技術專題知識第15頁一、酶免疫技術基礎原理:以酶標識抗體(或抗原)用于免疫檢測,經(jīng)過對應底物被酶解后顯色反應,對標本中抗原/抗體進行定量、定位分析。標識物:酶(催化底物:生物放大作用)特點:靈敏度高、特異性強、準確性好,酶標識試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定,檢測方法簡便安全易行,輕易與其它技術偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣新方法。免疫學技術專題知識第16頁(一)常見酶和酶作用底物1.辣根過氧化物酶(HRP)HRP起源于植物辣根中,分子量40KD,由主酶(糖蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)組成復合物。HRP常見底物有:(1)鄰苯二胺(OPD)
OPD顯色后為橙黃色,加入終止液為棕黃色,可溶性產物,應用最早,但配成溶液后穩(wěn)定性差,且有潛在致癌性,顯色反應需避光。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)TMB經(jīng)酶作用呈蘭色,可溶性產物,加酸終止后黃色,穩(wěn)定性好,顯色反應無需避光,無致突變作用。應用最廣泛。但水溶性差。免疫學技術專題知識第17頁2.堿性磷酸酶(AP)AP從大腸桿菌或小牛腸粘膜中提取,菌源性活力小于小腸粘膜活力。AP價格較HRP高,穩(wěn)定性差,但敏感度高,空白值低??纱呋瘜ο趸搅姿狨ィ╬-NPP),生成黃色對硝基酚,NaOH終止后黃色可穩(wěn)定存在一段時間(405nm)。免疫學技術專題知識第18頁
(二)酶免疫技術分類酶免疫組化
(EIH)
均相酶免疫測定(HEI)
酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定(EIA)
液相酶免疫測定(同RIA)免疫學技術專題知識第19頁(三)酶免疫測定(EIA)
1.均相酶免疫測定(HEI)特點:僅需將待測樣品、酶標試劑和底物溶液混合,待抗原抗體反應完成即可直接測定結果,整個檢測過程都在均勻液相中進行。以酶放大免疫測定技術(EMIT)為例:
免疫學技術專題知識第20頁2.非均相酶免疫測定(1)液相酶免疫測定(液相EIA):同RIA:抗原、酶標抗原、抗體相繼加入后,使反應到達平衡,再加分離劑。(2)固相酶免疫測定(固相EIA):AgAb反應在固相載體表面進行,應用最廣泛是酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA)免疫學技術專題知識第21頁1)ELISA基礎原理將抗原或抗體結合到固相載體表面,并保持其免疫活性。抗原或抗體與酶連接成酶標抗原或抗體,仍分別保持其免疫活性和酶活性。在固相載體上按照一定步驟加入待測抗原或抗體及酶標抗體或酶標抗原,洗去未結合游離物質,加入酶底物顯色,顏色深淺與待測物質含量呈相關性。免疫學技術專題知識第22頁2)固相載體種類A、塑料制品聚苯乙烯:蛋白質非共價鍵或物理吸附結合到載體表面,可制成小試管、小珠、微量反應板形式
專用于ELISA微量反應板——ELISA板(812=96孔)B、微顆粒高分子單體聚合成微球或顆粒,帶有能與蛋白質結合功效基團,易于化學偶聯(lián),結合容量大。反應時可均勻分散到整個反應溶液中,反應速度快。其中可包裹磁性物質,制成磁化微顆粒,使分離可在磁板中完成,自動化分析。C.膜載體NC膜(硝酸纖維素膜)、玻璃纖維素膜、尼龍膜等微孔濾膜。非共價鍵吸附Ab/Ag,吸附能力強。廣泛應用于斑點-ELISA等。免疫學技術專題知識第23頁3)ELISA方法類型及反應原理A.雙抗體夾心法此法是檢測大分子抗原常見方法。上述方法亦可改為雙位點一步法,使用針反抗原分子上兩個不一樣表位單克隆抗體,分別作為固相抗體和酶標抗體。注意鉤狀效應。免疫學技術專題知識第24頁B.間接法此法是測定抗體常見方法。能夠用一個酶標抗抗體檢測各種抗體。免疫學技術專題知識第25頁免疫學技術專題知識第26頁C.競爭結正當可用于測定小分子抗原或半抗原及抗體。以檢測抗原為例,待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,結合于固相酶標抗原量與標本中待測抗原含量呈反比。免疫學技術專題知識第27頁D.捕捉法——最常見于檢測IgM抗體
包被抗人IgM鏈+待測標本IgM類抗體全被固相抗體捕捉洗滌+特異性抗原(針對待測IgM對應抗原)與固相上特異性IgM結合+酶標抗體(針對特異性Ag)+底物顯色顯色表示有特異性IgM。免疫學技術專題知識第28頁E、BAS-ELISA生物素(B)-親和素(A)系統(tǒng)(biotinavidinsystem,BAS)是以生物素和親和素含有獨特結合特征為基礎,它們結合快速、專一、穩(wěn)定,并含有多級放大效應。應用生物素親和素放大系統(tǒng)ELISA,使反應信號放大,檢測靈敏度提升。
免疫學技術專題知識第29頁1個親和素(鏈霉親和素)可結合四個生物素衍化物1個抗體可結合多個B,與蛋白質-NH2結合形成肽鍵,-NH2越多,標識B越多。E
BAg?
E—B—A—B—EBAbB
BB
EE—B—A—B—E免疫學技術專題知識第30頁BAS-ELISA包含:
ABC-ELISA(間接法、雙抗體夾心法)
BA-ELISA(間接法、雙抗體夾心法)
BAB-ELISA(間接法、雙抗體夾心法)
比如:BAB-ELISA(雙抗體夾心法):
固相Ab+待檢Ag+(Ab-B)+A+B-E+底物顯色免疫學技術專題知識第31頁ABC-ELISA(間接法、雙抗體夾心法)免疫學技術專題知識第32頁(四)酶免疫組化(EIH)原理:以酶標識抗體與用于對應抗原反應,經(jīng)過底物被酶解顯色以示蹤抗原-抗體結合物存在部位。酶免疫組化染色標本可在普通光學顯微鏡下觀察,并能長久保留。另外,作為辣根過氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB),其分解產物為不溶性,適于鏡下觀察。免疫學技術專題知識第33頁1、直接法組織標本待測抗原+酶標識抗體——DAB顯色2.間接法組織標本待測抗原+Ab1+酶標-二抗使用一個酶標抗體可檢測各種抗原。敏感性較直接法高,但低于PAP法。免疫學技術專題知識第34頁3.生物素-親和素法將親和素(A)與生物素(B)系統(tǒng)應用于酶免疫組化包含:ABC法(直接法、間接法)BAB法(直接法、間接法)BA法(直接法、間接法)免疫學技術專題知識第35頁3.
1)ABC法直接ABC法:玻片Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-AB*C特點:將BAB法中A先與B·E結合,制備成復合物ABC間接ABC法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復合物結合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BABCAg-Ab1-Ab2·B-AB*C免疫學技術專題知識第36頁2)BAB法(橋聯(lián)親合素-標識生物素法—BRAB)直接BAB法:組織切片或細胞涂片Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特點:以游離A分別連接B·Ab和B·E間接BAB法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復合物結合組織切片或細胞涂片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BAAg-Ab1-Ab2·B-AB·EAg-Ab1-Ab2·B-A-B·E免疫學技術專題知識第37頁3)BA法(標識親合素-生物素法——LAB法)直接BA(或LAB)法玻片Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點:以A·E/SA·E代替BAB法中A,省卻了加B·E步驟間接BA(或LAB)法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復合物結合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BA·EAg-Ab1-Ab2·B-A·E免疫學技術專題知識第38頁
BAS試驗方法及反應層次
方法反應層次
直接法BAAg—(Ab-B)—A*BABAg—(Ab-B)—A—B*ABCAg—(Ab-B)—AB*C
間接法BAAg—Ab1—(Ab2-B)—A*
BABAg—Ab1—(Ab2-B)—A—B*
ABCAg—Ab1—(Ab2-B)—AB*C
Ag抗原;Ab-B生物素化抗體;
A親合素;A*標識親合素;
B生物素;B*標識生物素;
Ab1第一抗體;Ab2第二抗體;Ab2-B生物素化第二抗體免疫學技術專題知識第39頁4.過氧化物酶-抗過氧化物酶(peroxidaseanti-peroxidasecomplex,PAP)法和堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(alkalinephosphatase-antialkalinephosphatase,APAAP)法原理:應用抗酶抗體與酶結合,形成可溶性、穩(wěn)定酶-抗酶抗體復合物。此法優(yōu)點是:未經(jīng)化學交聯(lián)反應,故防止了抗體和酶活性降低,并省去酶標識抗體需純化繁復過程。免疫學技術專題知識第40頁二、熒光免疫技術(fluoroimmunoassay)原理:以熒光素標識抗體或抗原,用于對應抗原或抗體分析判定。熒光免疫技術分為:免疫熒光顯微技術(熒光免疫組化):用熒光抗體對細胞、組織切片或其它標本中抗原(或抗體)進行判定和定位檢測,可在熒光顯微鏡下直接觀察試驗結果,流式細胞術:進行自動分析檢測熒光免疫測定:用于檢測體液標本中抗原或抗體。免疫學技術專題知識第41頁(一)常見熒光色素1、異硫氰酸熒光素(FITC)
橙黃色/黃色粉末,發(fā)出黃綠色熒光。最大吸收峰490—495nm,最大發(fā)射峰520—530nm,含異硫氰基N=C=S。應用最多熒光素。2、四乙基羅丹明(RB200)
橘紅色粉末,發(fā)出橘紅色或橙色熒光。最大吸收峰570nm,最大發(fā)射峰595—600nm。含磺酸基。與FITC做雙標識或對比染色。3.藻紅蛋白(R-RE)發(fā)出橙色熒光,最大吸收峰565nm,最大發(fā)射峰575nm,可與FITC共用488nm激發(fā)光,可用于流式細胞儀雙標識。免疫學技術專題知識第42頁(二)免疫熒光顯微技術1.方法及原理1)直接法應用特異性熒光抗體直接檢驗標本中對應抗原。2)間接法以特異性抗體(或待測抗體)為第一抗體,以熒光素標識抗球蛋白抗體(標識抗抗體)為第二抗體,用于檢測抗原或抗體。免疫學技術專題知識第43頁3)補體法此法是在間接法第一步抗原-抗體反應加入補體,使之與抗原-抗體復合物結合;再用熒光素標識抗補體抗體進行示蹤。4)雙標識法此法用異硫氰酸熒光素(FITC)及羅丹明(TRITC)分別標識不一樣抗體,進行同一標本熒光染色,若有兩種對應抗原存在,可同時見兩種(橙紅、黃綠)熒光。免疫學技術專題知識第44頁2.熒光顯微鏡檢驗1)染色標本盡可能馬上觀察結果。2)鏡下觀察時同一標本區(qū)觀察時間不易過長。3)通風很好暗室中進行。4)油鏡檢驗時用無熒光鏡油,先觀察對照,再對待測標本。
免疫學技術專題知識第45頁(三)流式細胞術(FCM)FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀,對單個細胞表面標志(抗原或受體)進行快速、準確分析和自動檢測,并可對不一樣類型細胞進行分選和搜集。FCM還可對同一細胞各種參數(shù)(如DNA.RNA.蛋白質和細胞體積等)進行多信息分析,故成為當代生命科學研究領域中被廣泛應用一項新技術。免疫學技術專題知識第46頁1.基礎概念與原理FCM是一個分析單個微粒(如細胞、微生物和人工合成微球等)物理和化學特征技術,其特點是快速、準確、客觀,能定量。FCM原理:懸浮在液體中分散細胞單個地依次經(jīng)過測量區(qū)時產生電信號,從而可快速對大量細胞進行多參數(shù)檢測和分析,并可從整個群體中分選出特定細胞亞群。免疫學技術專題知識第47頁免疫學技術專題知識第48頁2.流式細胞術在免疫細胞研究中應用1)細胞表型分析表型分析可用于免疫細胞判定、計數(shù)和功效評價。2)細胞功效檢測(1)細胞功效狀態(tài)和活化信號轉導:包含檢測胞內鈣離子濃度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性狀態(tài)、信息傳遞相關蛋白表示及相互作用等。免疫學技術專題知識第49頁(2)細胞增殖:應用活細胞染料5’-二醋酸羧基熒光素琥珀酸單胞菌酯(5’-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)作為標識物,建立了檢測細胞增殖新技術。原理:CFSE能自動穿過胞膜,與胞內蛋白賴氨酸不可逆結合,并隨細胞分裂而倍減,借助FCM檢測熒光強度,可判斷細胞增殖狀態(tài)。免疫學技術專題知識第50頁(3)細胞分化:借助胞內細胞因子染色(intracelluarcytokinestaining,ICCS),可應用FCM檢測單細胞產生和分泌CK,從而判斷單一細胞亞群分化和功效狀態(tài)。原理:應用蛋白轉運抑制劑使胞內合成CK滯留在高爾基體;應用透膜劑(saponin)使熒光標識抗體可逆性穿透胞膜,以進行胞內染色。免疫學技術專題知識第51頁(4)細胞毒效應:經(jīng)過檢測一些效應分子(FasL、穿孔素和顆粒酶等)可判斷細胞毒效應。(5)細胞凋亡:見下文。免疫學技術專題知識第52頁(四)熒光免疫測定(FIA)1.熒光偏振免疫測定(FPIA)該法主要用于小分子物質(尤其是藥品濃度)測定。原理:熒光素標識已知抗原+待測抗原+抗體——形成標識抗原抗體復合物,因為其分子量大,旋轉慢,在激發(fā)光照射下,吸收偏振光多,發(fā)出偏振熒光強,小分子游離標識抗原旋轉快,其偏振熒光弱。所以,標本中抗原濃度越高,形成標識抗原抗體復合物越少,發(fā)出偏振熒光越弱。反之,發(fā)出偏振熒光越強。免疫學技術專題知識第53頁2.時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)原理:應用含有較長熒光壽命鑭系螯合物(如銪)標識抗原或抗體,并利用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間,有效消除非特異性本底熒光干擾,所得信號完全是鑭系螯合物發(fā)射特異熒光,從而最大程度提升測定方法靈敏度和特異性。免疫學技術專題知識第54頁免疫學技術專題知識第55頁3.酶免疫熒光測定(ELFIA)原理:應用含有潛在熒光物質作為酶底物,經(jīng)過酶解反應產生高強度熒光,可用熒光測量儀進行定量測定。免疫學技術專題知識第56頁三、放射免疫技術是以放射性核素作為示蹤劑標識免疫測定方法,其特點是將核素分析高靈敏度與抗原-抗體反應特異性相結合。廣泛應用于各種微量蛋白質、激素、小分子藥品和腫瘤標志物定量分析,對相關學科發(fā)展起到了極大推進作用。包含放射免疫測定(RIA)和免疫放射測定(IRMA)免疫學技術專題知識第57頁(一)常見放射性核素射線:131I、125I、51Cr、60Co射線:14C.3H、32P射線半衰期長,易造成對環(huán)境污染,比活性差,需液體閃爍儀。普通不用。免疫學技術專題知識第58頁(二)放射免疫測定(RIA)1.RIA基礎原理以放射性核素標識抗原(Ag*)和檢品中待測未標識抗原(Ag)與固定量特異性抗體競爭結合反應。若Ag*和Ab量固定,二者結合所形成Ag*-Ab復合物受Ag含量制約。若反應系統(tǒng)中Ag含量高,其對Ab競爭結合能力即強,Ag-Ab復合物生成量增加,Ag*-Ab復合物則相對降低。所以,Ag*Ab復合物形成量與Ag含量間呈一定負相關函數(shù)關系。免疫學技術專題知識第59頁Ag*+Ab
Ag*Ab+Ag*
+
Ag
AgAb+Ag
BFB0T
免疫學技術專題知識第60頁2、RIA測定方法1)AgAb反應2)B.F分離加入PR試劑(二抗和PEG混合物,也可制成固相二抗(二抗與顆粒固相物連接)Ag*Ab1+Ab2——Ag*Ab1-Ab23)放射性強度測定
——計數(shù)儀測上清/沉淀cpm,制備標準曲線(B/(B+F),B/F,B/B0)。亦可用計算機處理。免疫學技術專題知識第61頁(三)免疫放射測定(IRMA)1、單位點IRMA是將待測抗原與過量標識抗體直接反應,然后加入固相抗原免疫吸附劑與游離標識抗體結合經(jīng)離心去除沉淀物,測定上清液放射性強度,從而推算出檢品中待測抗原含量。2.雙位點IRMA測定固相上cpm數(shù)免疫學技術專題知識第62頁四、化學發(fā)光免疫技術是將發(fā)光技術與免疫反應和計算機技術結合自動化儀器分析技術,當前已趨替換RIA而成為免疫檢測廣泛采取分析技術??捎糜诙囗椫笜藱z測??蓽y定內分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥品濃度、骨代謝指標和貧血類等方面檢測。
免疫學技術專題知識第63頁(一)化學發(fā)光免疫測定(CLIA)CLIA是以化學發(fā)光劑(如魯米諾、吖啶酯等)標識抗體或抗原,免疫反應完成后,直接引發(fā)化學發(fā)光反應進行檢測。免疫學技術專題知識第64頁(二)化學發(fā)光酶免疫測定(CLEIA)CLEIA抗原-抗體反應步驟與酶免疫測定相同,僅酶促反應所用底物為發(fā)光劑,經(jīng)過化學發(fā)光反應進行檢測。免疫學技術專題知識第65頁(三)電化學發(fā)光免疫測定(ECLIA)
ECLIA實際上是在電極表面由電化學引發(fā)特異性化學發(fā)光反應。三聯(lián)吡啶釕RU(bpy)32+三丙胺(TPA).免疫學技術專題知識第66頁電化學發(fā)光免疫分析示意圖免疫學技術專題知識第67頁電化學發(fā)光免疫測定示意圖免疫學技術專題知識第68頁五、免疫金標識技術(immunogoldlabellingtechnique)氯金酸(HAuCl4)在還原劑(枸櫞酸三鈉)作用下被還原成原子金,聚合成特定大小金顆粒懸液,并因為靜電作用成為一個穩(wěn)定膠體狀態(tài)——膠體金。是以膠體金作為示蹤標志物,應用于抗原-抗體反應。膠體金含有高電子密度,最初主要用于免疫電鏡技術,以后其應用范圍逐步擴展。在免疫組化方面,膠體金標識抗體可直接用于檢測細胞表面和組織切片中抗原或受體,并可在普通光學顯微鏡下觀察。在流式細胞術中,膠體金可作為多參細胞分析和分選有效標識物。免疫學技術專題知識第69頁常見方法:1.免疫金(銀)染色法(IGS/IGSS)組織切片(抗原)+特異性抗體+膠體金標記二抗+銀顯影劑,標識物上金顆粒催化硝酸銀離子還原成銀顆粒,在抗原抗體復合物上形成黑色“銀殼”,使Ag位置放大,從而提高了鏡下可見度。
免疫學技術專題知識第70頁用NC膜或微孔濾膜為載體吸附抗原,用膠體金標識抗體代替酶標抗體。2.斑點免疫層析試驗(DICA)免疫學技術專題知識第71頁六、免疫印跡技術(immunoblotting)又稱為Western-blotting,是將凝膠電泳高分辨力與固相免疫測定結合起來一個方法。由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)、蛋白質轉印和固相膜免疫測定三項技術結合而成。免疫學技術專題知識第72頁七、免疫PCR(immuno-PCR,IM-PCR)是將免疫學反應和PCR技術相結合而創(chuàng)建一個新檢測技術,含有抗原、抗體反應特異性和PCR技術高效性?;A原理:用一段已知DNA分子作為標識物,結合一抗或二抗后去檢測對應抗原或抗體,再用PCR法擴增該DNA分子,擴增產物用瓊脂糖電泳定性,依據(jù)該DNA分子存在是否,確定檢測結果。該方法與ELISA原理類似,不一樣是以DNA分子作為標識物。免疫PCR可采取直接法、間接法和雙抗體夾心法。免疫學技術專題知識第73頁免疫學技術專題知識第74頁八、細胞凋亡檢測技術(一)形態(tài)學檢測①應用電子顯微鏡或普通光學顯微鏡直接觀察細胞大小、凋亡小體和其它凋亡細胞形態(tài)學改變;②應用一些可直接、間接產生熒光染料[如雙苯并咪唑(HO)、碘化丙啶(PI)、AnnexinV等]使細胞著染,借助熒光顯微鏡區(qū)分凋亡細胞、壞死細胞和正常細胞。免疫學技術專題知識第75頁(二)生物化學檢測方法凋亡細胞染色質DNA在核小體單位間連接處斷裂,形成180~200bp整數(shù)倍寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。(三)免疫學檢測方法原理:凋亡細胞染色質DNA斷裂而產生核小體DNA,可與組蛋白結合為復合物。應用抗組蛋白和抗DNA單抗,借助ELISA方法可測定細胞凋亡。該技術優(yōu)點是:①可用于檢測不一樣培養(yǎng)細胞株或不一樣動物起源細胞凋亡;②靈敏度高,且可檢測早期細胞凋亡。免疫學技術專題知識第76頁(四)分子生物學檢測方法常見技術為脫氧核糖核酸末端轉移酶介導缺口末端標識法(TUNEL),原理:凋亡細胞DNA鏈發(fā)生斷裂而暴露3’-OH末端,可借助末端轉移酶(TdT)將脫氧核糖核酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成衍生物標識到DNA3’-OH末端,從而檢測細胞凋亡。TUNEL法優(yōu)點是:能對完整單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色;適合用于不一樣本檢測;靈敏度遠比普通組織化學和生化測定法高。免疫學技術專題知識第77頁免疫學技術專題知識第78頁(五)流式細胞術1.亞“G1”峰檢測法處于增殖周期細胞,其在不一樣周期時相(Go/G1.S、G2/M)DNA含量為2n~4n。凋亡細胞核內DNA裂解成小片段,應用胞膜通透劑可使小分子量DNA片段穿過胞膜而丟失,僅剩大片段DNA,這些失去個別DNA細胞,染色后形成一個DNA含量<2n(即<G1期細胞)分布區(qū),稱為“亞G1峰”。該技術缺點為:不能反應發(fā)生于G1峰后S期和G2期細胞凋亡;不能區(qū)分死細胞和活細胞。免疫學技術專題知識第79頁2、HO/PI染色法原理:HO被活細胞攝取,與DNA結合后在紫外光下呈藍色熒光;PI使死細胞著染,產生紅色熒光。依據(jù)兩種熒光所形成細胞二維直方圖,可分辨正?;罴毎?、凋亡細胞和死細胞。3.Annexin法應用AnnexinV,AnnexinV是一個Ca2+依賴磷脂結合蛋白,含有易于結合到磷脂類如PS(磷脂酰絲氨酸)特征。對PS有高度親和性。借助FCM可定量分析被標識凋亡與壞死細胞數(shù)。免疫學技術專題知識第80頁4.caspase活性檢測caspase(胱天蛋白酶)水平及活性升高乃細胞凋亡標志,并反應效應細胞細胞毒活性。應用能透過胞膜caspase熒光底物,其被酶切后釋放熒光基團,借助FCM檢測所釋放熒光強度,可推斷caspase活性。該法優(yōu)點為:可在單細胞水平反抗原特異性T細胞細胞毒作用進行可視化和數(shù)量化分析。免疫學技術專題知識第81頁第二節(jié)
免疫分子檢測免疫學技術專題知識第82頁一、免疫球蛋白測定檢測IgG、IgA.IgM含量常見單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法以及免疫化學自動分析儀。血清中IgE和IgD含量很低,須用RIA.ELISA.RAST等靈敏度較高方法測定。免疫學技術專題知識第83頁二、補體測定(一)血清總補體活性測定原理:應用家兔抗SRBC抗體致敏SRBC作為抗原-抗體復合物,激活待測血清中補體經(jīng)典路徑,造成SRBC溶解;若待測血清樣品中補體含量降低或某種補體成份缺失,可影響此種溶血反應。通常以50%溶血作為判定反應結果終點,故稱為50%溶血試驗(50%complementhemolysis,CH50)。依據(jù)引發(fā)50%溶血所需最小補體量,計算血清總補體活性。免疫學技術專題知識第84頁(二)血清補體旁路路徑活性測定原理:家兔紅細胞(RRBC)可直接激活人B因子,引發(fā)補體旁路路徑活化,造成RRBC溶解。(三)補體各成份測定1、免疫溶血法該法可用于C4.C2及B因子測定。以抗體致敏SRBC作為指示系統(tǒng)進行檢測。2、免疫化學法常見方法有單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法、ELISA及RIA等。免疫學技術專題知識第85頁三、細胞因子及其受體檢測(一)生物學檢測法原理為:依據(jù)CK特定生物學活性,采取對應指示系統(tǒng)(如各種依賴性細胞株或靶細胞),經(jīng)過與標準品對比,判斷樣品中細胞因子活性水平,普通以活性單位(U/ml)表示??煞譃榇龠M細胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、細胞毒活性測定法、細胞病變抑制法、趨化活性測定法等。免疫學技術專題知識第86頁生物學檢測法優(yōu)點:靈敏度高(達pg水平),并能直接顯示CK生物活性。生物學檢測法缺點:各種CK可能含有相同功效,故干擾原因較多;一些抑制因子可降低CK活性;一些細胞同時表示CK受體,其與CK結合將影響生物學活性檢測結果。免疫學技術專題知識第87頁(二)免疫學檢測法1.體液中CK檢測幾乎全部CK均可借助免疫學方法進行檢測。常見方法包含ELISA(雙抗體夾心法或競爭法)、RIA及免疫印跡法等。一些細胞因子含量甚微樣品(如腦脊液)可用免疫PCR(immuno-PCR)進行檢測,極大地提升檢測靈敏度(可達1012mol/L)。免疫學技術專題知識第88頁2.單個細胞分泌CK檢測(1)反向溶血空斑試驗(reversedhemolyticplaqueassay,RHPA)RHPA是一個體外檢測抗體分泌細胞試驗。亦可將其用于測定CK分泌細胞。原理:待測CK分泌細胞+抗CK抗體+SPA-SRBC+補體,4種成份與瓊脂糖凝膠混勻,注入小室內;反應后造成SRBC溶解,在CK分泌細胞周圍形成溶血空斑,每個空斑代表一個CK分泌細胞,空斑大小與細胞所分泌CK量成正比。免疫學技術專題知識第89頁(2)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)原理:抗CK抗體包被固相載體+待測分泌CK細胞+結合后洗去細胞+酶標抗CK抗體+底物,顯色反應深淺測定結合在固相載體上CK量,并可在光鏡下觀察分泌CK細胞。免疫學技術專題知識第90頁免疫學技術專題知識第91頁3.細胞內CK檢測采取FCM免疫熒光技術可從單細胞水平檢測不一樣細胞亞群中CK,用不一樣顏色熒光標識抗CK抗體可在同一細胞內同時測定兩種不一樣CK。免疫學技術專題知識第92頁免疫學檢測法優(yōu)點:①特異性強,可測出單一細胞因子含量;②方法簡便,無須細胞培養(yǎng),便于大量樣品檢測;③試驗流程短,方法易標準化,重復性好免疫學檢測法缺點:①免疫學方法所檢出細胞因子含量,與該因子生物活性并非必定平行;②不一樣單抗所識別細胞因子表位和親和力不一樣,所測結果可出現(xiàn)差異。免疫學技術專題知識第93頁(三)分子生物學檢測法應用細胞因子cDNA探針或寡核苷酸探針,經(jīng)放射性核素(32P或35P)、生物素或地高辛標識,與提取細胞因子mRNA進行雜交(Northernblot);亦可在細胞或組織切片上進行原位雜交分析;若同時結合免疫組化技術,還可判定表示細胞因子基因細胞類型。免疫學技術專題知識第94頁分子生物學檢測法優(yōu)點:特異性高。分子生物學檢測法缺點:僅能檢測CK基因表示情況,不能直接提供CK含量及生物活性等信息,故此法主要用于研究CK基因表示與調控。免疫學技術專題知識第95頁四、黏附分子檢測(一)細胞膜表面AM檢測1、間接免疫熒光法——組織細胞表面AM組織切片標本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG熒光抗體,進行間接免疫熒光染色,借助熒光顯微鏡觀察表示AM陽性細胞數(shù)。2、間接酶免疫組化法——組織細胞表面AM組織切片標本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG酶標抗體,加入酶底物顯色,顯微鏡觀察表示AM陽性細胞數(shù)。3.流式細胞術——內皮、淋巴細胞等表面AM待檢細胞懸液+兩種熒光素標識單抗,在流式細胞儀上可同時檢測胞膜表面兩種不一樣AM。免疫學技術專題知識第96頁(二)可溶性AM測定1、ELISA雙抗體夾心:最常見于檢測選擇素家族和免疫球蛋白超家族組員。2、其它免疫測定方法:RIA或IRMA.化學發(fā)光免疫測定、時間分辨熒光免疫測定方法等免疫學技術專題知識第97頁第三節(jié)
免疫細胞檢測一、免疫細胞分離與純化(一)白細胞分離1、自然沉降法2.高分子聚合物加速沉降法免疫學技術專題知識第98頁(二)外周血單個核細胞(PBMC)分離1、聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F(xiàn)-H)密度梯度離心法2.Percoll密度梯度離心法(連續(xù)和不連續(xù))免疫學技術專題知識第99頁(三)淋巴細胞純化與亞群分離1、去除紅細胞普通采取無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。2.去除血小板離心洗滌或胎牛血清(FCS)梯度離心法,因FCS可讓單個核細胞經(jīng)過,而阻止血小板經(jīng)過。免疫學技術專題知識第100頁3.去除單核細胞和粒細胞(1)黏附法玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱,清除發(fā)生黏附細胞(2)羰基鐵粉吞噬法單核細胞吞噬羰基鐵粉后,用磁鐵將細胞吸至管底(3)苯丙氨酸甲酯法苯丙氨酸甲酯含有親溶酶體性質,用該法可溶解含溶酶體細胞(如單核、粒細胞等)。免疫學技術專題知識第101頁4.淋巴細胞亞群分離(1)E花環(huán)分離法T細胞表示SRBC受體,能與SRBC結合形成E花環(huán),而B細胞則不能。經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心,可將T、B細胞分離。(2)尼龍棉柱分離法B細胞易黏附于尼龍棉纖維(聚酰胺纖維)表面,而T細胞則不易黏附,借此可將T細胞與B細胞分離。免疫學技術專題知識第102頁(3)親和板結合分離法(洗淘法)直接結正當:抗體包被塑料平皿或細胞培養(yǎng)瓶(板)+細胞,吸附表示特定抗原細胞。間接結正當:包被抗小鼠IgG抗體(第二抗體)+與單抗結合淋巴細胞,被吸附固定而分離。特異性抗原(配體)包被+表示對應受體細胞,該細胞被分離。免疫學技術專題知識第103頁優(yōu)點:可同時進行細胞陽性分選和陰性分選,且所獲細胞量較大。缺點:親和板結合分離法普通適合進行陰性分選。另外,包被抗體宜采取不含F(xiàn)c段(Fab’)2抗體片段,以免發(fā)生非特異性吸附。免疫學技術專題知識第104頁(4)補體細胞毒分離法抗體+細胞+補體,經(jīng)過補體依賴細胞毒作用(CDC)而去除對應細胞,用于細胞陰性分選。(5)流式細胞術分選法免疫學技術專題知識第105頁直接法:將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián),稱為免疫磁珠(IMB),其可與表示對應膜抗原細胞結合;應用強磁場分離IMB及其所吸附細胞,從而對特定細胞進行陰性或陽性分選。間接法:用抗小鼠IgG抗體(第二抗體)包被磁性微珠,可與任何已結合鼠源性單克隆抗體(一抗)細胞發(fā)生反應,從而對細胞進行分離。(6)磁性激活細胞分離器(MACS)分離法
免疫學技術專題知識第106頁MACS分離法優(yōu)點:所獲細胞純度高(93%~99%),獲率可達90%,活細胞率>95%;分離效果可與流式細胞術相媲美,但比后者省時且費用低,操作簡單。缺點:陽性分選中,抗體可造成細胞活化或細胞凋亡。免疫學技術專題知識第107頁(四)單核-吞噬細胞分離和搜集1、將PBMC經(jīng)過Percoll連續(xù)密度梯度離心法或洗淘法(陽性分選)可獲取單核細胞,但所得細胞數(shù)量較少。2、斑蝥敷貼法能夠從組織滲出液中取得數(shù)量較多且較純巨噬細胞,亦無需作深入分離。3.以滅菌巰基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基(或無菌液體石蠟)注入小鼠腹腔內,引發(fā)無菌性炎性滲出,從腹腔沖洗液中可取得大量巨噬細胞(>85%)。免疫學技術專題知識第108頁二、淋巴細胞及其亞群檢測(一)T細胞檢測計數(shù)1、間接免疫熒光法應用抗CD3/CD4/CD8單抗與PBMC結合,再加入熒光素標識抗小鼠IgG抗體(第二抗體),在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。2、酶免疫組化法1)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APAAP)法;2)ABC法(間接法)細胞涂片+單抗+二抗-B+AB*C+底物顯色3、流式細胞術采取流式細胞儀計數(shù)4.免疫金銀染色法(IGSS)免疫學技術專題知識第109頁(二)B細胞檢測計數(shù)1、膜表面免疫球蛋白(mlg)檢測細胞涂片+熒光素標識抗Ig抗體(免疫熒光法)/+酶標識抗Ig抗體(酶免疫組化法)2、間接免疫熒光法細胞+CD19/CD20/CD21/CD22等單抗+熒光素標識二抗,判定和檢測計數(shù)B細胞。3、流式細胞術4.B細胞亞群檢測采取流式細胞儀,標識CD5單抗和標識CD19單抗,判定B1細胞和B2細胞。免疫學技術專題知識第110頁三、免疫細胞功效測定(一)吞噬細胞功效測定1.中性粒細胞趨化功效測定(1)濾膜滲透法(Boyden小室法)在上室加入待測細胞,下室加入趨化成份,上下室間被含有一定孔徑和厚度纖維膜隔開,反應后取纖維膜清洗后進行固定、染色和透明化,在高倍鏡下觀察細胞穿越纖維膜移動距離,從而判斷其趨化作用。免疫學技術專題知識第111頁(2)瓊脂糖平板法:在瓊脂糖平板中央孔內加白細胞懸液,兩側孔內分別加趨化因子或對照液,反應后經(jīng)過固定和染色,觀察細胞定向移動能力。免疫學技術專題知識第112頁2.中性粒細胞吞噬、殺菌功效測定(1)顯微鏡檢法白細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合、溫育,取樣制片、固定、染色;在油鏡下觀察多形核白細胞對細菌吞噬情況,計算其吞噬率(%)和吞噬指數(shù)(phagocyticindex)及殺菌率。免疫學技術專題知識第113頁(2)硝基藍四氮唑(NBT)還原試驗中性粒細胞在吞噬、殺菌過程中,能量消耗驟增,氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代謝活性增強;葡萄糖分解中間產物6-磷酸葡萄糖在氧化脫氫轉變?yōu)槲焯沁^程中,所釋放氫被攝入吞噬體NBT染料接收,使其被還原成藍黑色點狀或塊狀甲臢顆粒,沉積于中性粒細胞胞質內。普通以陽性細胞數(shù)超出10%判定為NBT試驗陽性。免疫學技術專題知識第114頁3、巨噬細胞吞噬功效測定巨噬細胞+雞紅細胞(含有清楚可見胞核)吞噬試驗,計算吞噬率和吞噬指數(shù)。4.巨噬細胞胞毒作用測定用-干擾素激活小鼠腹腔巨噬細胞,觀察其對125I-UdR標識小鼠肥大細胞瘤P815殺傷活性。免疫學技術專題知識第115頁(二)T細胞功效測定1、T細胞增殖(轉化)試驗T細胞在體外受抗原或絲裂原(PHA.ConA)刺激后,細胞代謝和形態(tài)發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為胞內蛋白質和核酸合成增加,發(fā)生一系列增殖反應,并轉變?yōu)榱馨湍讣毎#?)形態(tài)學觀察:依據(jù)淋巴母細胞轉化形態(tài)學特征,借助光學顯微鏡進行檢測。優(yōu)點:方法較簡單,無需特殊儀器設備。缺點:依靠肉眼觀察形態(tài)學改變,準確性較差。免疫學技術專題知識第116頁(2)放射性核素(3H-TdR、125I-UdR)摻入法:T細胞增殖,其胞內新合成DNA需攝取核苷酸原料,故應用核素標識核苷酸參加反應,經(jīng)過測定放射性強度可反應淋巴細胞增殖水平。優(yōu)點:靈敏,可自動
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