第8章-分光光度法

第八章吸光光度法1化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er

0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃,測定絕對值。

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er

1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器

測定相對值。準(zhǔn)確度高靈敏度高28.1吸光光度法的基本原理特點(diǎn):靈敏度高：測定下限可達(dá)10-5～10-6mol/L,10-4%～10-5%準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2～5％（精密光度計(jì)為1～2％）操作簡便快速應(yīng)用廣泛

吸光（分光）光度法是基于被測物質(zhì)分子對光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。3研究物質(zhì)在紫外(200-400nm)、可見光區(qū)(400-800nm)

的分子吸收光譜

的分析方法稱為紫外-可見分光光度法。

這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量測定。4光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5

m2.5

m

~50

m50

m

~300

m5溶液中溶質(zhì)分子對光的吸收與吸收光譜

/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠不同顏色的可見光波長及其互補(bǔ)光6300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2AbsorbanceCr2O72-、MnO4-的特征吸收曲線（吸收曲線,A~

）3507苯和甲苯在環(huán)己烷中的特征吸收曲線苯(254nm)甲苯(262nm)A

23025027084.光吸收基本定律:Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760年)A=lg(I0/It)=k1b比爾定律(1852年)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介質(zhì)厚度(cm)9吸光度與光程的關(guān)系A(chǔ)=

bc

光源檢測器0.00吸光度檢測器b樣品光源0.22吸光度光源檢測器0.44吸光度b樣品b樣品10吸光度與濃度的關(guān)系

A=

bc

b2>b1

吸光度0.00光源檢測器

吸光度0.22光源檢測器b1

吸光度0.42光源檢測器b211吸光度的加和性與吸光度的測量A=A1+A2+…+An

用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等。12T－透光率（透射比）（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbcA

：Absorbency，Absorbence，吸光度13吸光度A、透射比T與濃度c的關(guān)系A(chǔ)TcA=kbc14朗伯-比爾定律的適用條件單色光

應(yīng)選用

max處或肩峰處測定2.吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)3.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)15

01234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20溶液濃度的測定A＝abc工作曲線法(標(biāo)準(zhǔn)曲線)朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用16偏離Beer定律的因素依據(jù)Beer定律，A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點(diǎn)的直線偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面（一）光學(xué)因素（二）化學(xué)因素

正偏離，結(jié)果偏低負(fù)偏離，結(jié)果偏高17（一）光學(xué)因素

1．非單色光的影響：

Beer定律應(yīng)用的重要前提——入射光為單色光，

max

照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度18續(xù)前2．雜散光的影響：

雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值3．反射光和散色光的影響：反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對T產(chǎn)生影響散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形注：一般可用空白對比校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形19（二）化學(xué)因素Beer定律適用的另一個前提：稀溶液濃度過高會使C與A關(guān)系偏離定律208.2比色法和分光光度法

8.2.1比色法方便、靈敏，準(zhǔn)確度差。常用于限界分析。觀察方向1.目視比色法c4c3c2c1c1c2c3c4212.光電比色法通過濾光片得一窄范圍的所謂單色光(幾十nm)光電比色計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖靈敏度和準(zhǔn)確度較差228.2.2分光光度法通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是由五個部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示系統(tǒng)。

光源 單色器吸收池檢測器顯示系統(tǒng)23分光光度計(jì)的主要部件1、光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度,而且穩(wěn)定。 可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)2、單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。

棱鏡:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm

光柵:波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便“熱光源”“氣體放電燈”243、吸收池：(比色皿)用于盛待測及參比溶液。 可見光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池4、檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。 光電池，光電管，光電倍增管5、顯示系統(tǒng)： 低檔儀器：刻度顯示

中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄25棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同單色器入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040026光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.27檢測器SeAu，Ag半導(dǎo)體h

硒光電池Ag、Au28光電管紅敏管625-1000nm藍(lán)敏管200-625nmNi環(huán)（片）堿金屬光敏陰極h

29光電倍增管待掃描160-700nm1個光電子可產(chǎn)生106～107個電子30分光光度計(jì)的類型311、單光束分光光度計(jì)：分光后的單色光直接透過吸收池，輪流測定蠶比溶液和樣品溶液。普遍使用的有：721型：單色器為棱鏡，適用波長350-800nm，由微安表讀數(shù)；722型：單色器為光柵，適用波長330-800nm，數(shù)字顯示讀數(shù)；751型：單色器為石英棱鏡，適用波長200-1000nm，電位補(bǔ)償式讀數(shù)；752型：單色器為光柵，適用波長200-1000nm，數(shù)字顯示讀數(shù)；322、雙光束分光光度計(jì)：從光源發(fā)出的光經(jīng)分光后由扇形旋轉(zhuǎn)鏡分成兩束，交替通過參比液和樣品液，然后經(jīng)反射鏡交替投射到檢測器上。檢測器在瞬間接受處理參比信號和樣品信號，將其信號差轉(zhuǎn)換為吸光度。雙光束儀器克服了單光束儀器由于光源不穩(wěn)所引起的誤差。3、雙波長分光光度計(jì)：從光源發(fā)出的光經(jīng)過兩個單色器后，得到不同的兩束單色光，交替照射同一溶液，由測量系統(tǒng)顯示出兩個波長下的吸光度的差值，其差值與待測組分的濃度成正比。雙波長分光光度計(jì)的特點(diǎn)是降低雜散光，能測定一般光度計(jì)不宜測定的渾濁溶液。338.3顯色反應(yīng)及其影響因素8.3.1顯色劑與顯色反應(yīng)無機(jī)顯色劑:SCN-

[Fe(SCN)]2+H2O2

[TiO·H2O2]2+缺點(diǎn)：生成的配合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性較差。有機(jī)顯色劑:

與金屬離子能形成穩(wěn)定的有色配合物，具有很高的靈敏度和選擇性。34有機(jī)顯色劑

CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸35顯色反應(yīng)的選擇*靈敏度高，一般ε>104*選擇性好*顯色劑在測定波長處無明顯吸收。

對照性好,

λmax>60nm.*反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定。*顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。368.3.2顯色條件的確定c(R)c(R)c(R)1.顯色劑用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅Fe(SCN)n3-n拐點(diǎn)372.顯色反應(yīng)酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH383.顯色溫度及顯色時間另外，還有介質(zhì)條件、有機(jī)溶劑、表面活性劑等T1(℃)T2(℃)t(min)A398.3.3干擾及消除Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍(lán))⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測Co2＋(含F(xiàn)e3+):(掩蔽法)1.化學(xué)法40Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnR

NiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

鈷試劑RH+測Co2＋

:(生成絡(luò)合物性質(zhì)不同)如不能通過控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法。測Fe3＋:(控制pH)Fe3+,Cu2+FeSS

（紫紅）Cu2+pH2.5SS412.物理法—選擇適當(dāng)?shù)臏y定波長515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡(luò)合物絡(luò)合物試劑試劑42

1.僅絡(luò)合物有吸收，待測液沒有吸收，溶劑（水）作參比。

如phen—Fe2+

標(biāo)準(zhǔn)曲線2.待測液也有吸收，待測液作參比。

如測汽水中的Fe3.顯色劑或其他試劑也有吸收，空白溶液作參比

例:鄰二氮菲光度法測Li2CO3中的Fe，

參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。4.干擾組分與顯色劑有反應(yīng),又無法掩蔽消除時：

1）掩蔽被測組分，再加入顯色劑，作參比.2）加入等量干擾組分到空白溶液中,作參比.

--選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?38.4吸光光度法定量方法1、絕對法2、標(biāo)準(zhǔn)對照法

C樣＝A樣/A標(biāo)·C標(biāo)3、比吸收法

含量＝E樣/E標(biāo)·C標(biāo)A＝abc4、標(biāo)準(zhǔn)曲線法

01234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20448.5吸光光度法的應(yīng)用1.單一組分測定1)金屬離子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-鈷試劑2)磷的測定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,

可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬黃(

小)磷鉬(V)藍(lán)(

大)Sn2+453)蛋白質(zhì)測定—溴甲酚綠、考馬司亮藍(lán)等4)氨基酸測定—茚三酮(紫色化合物)5)水質(zhì)檢測:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+----6)藥物含量測定—比吸光系數(shù)定量；荷移光譜法測定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白質(zhì)等。462.多組分的測定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y標(biāo)液在

1,

2處分別測得在

1處測組分x,在

2處測組分yb)在

1處測組分x;在

2處測總吸收,扣除x吸收,可求yc)x,y組分不能直接測定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在

1處測得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在

2處測得A2)473.絡(luò)合物組成的測定(1)摩爾比法:固定cM,改變cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

48(2)等摩爾連續(xù)變化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:249表觀形成常數(shù)的測定(設(shè)M、R均無吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0Ac(M)=c(R)=cMmRn型?508.6應(yīng)用實(shí)例518.6.1天然水中Fe2+的測定鄰