藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析前質量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測分析前質量保證根據(jù)臨床檢驗實驗室的條件確定合適的分子診斷項目和恰當?shù)臉颖咎幚硎谴_保核酸定性定量檢測準確性的關鍵。標本在檢測前必須確保標本的采集、運輸和儲存符合要求。標本處置不當可能引起核酸降解，導致定量檢測結果不準確。1采樣前準備1）分子診斷項目的申請與完善藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測采樣前需填寫規(guī)范的申請單，申請單應包含足夠的信息，以識別患者和有資格開具申請單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應根據(jù)臨床需求合理選擇分子診斷項目。個體化用藥領域發(fā)展迅速，臨檢實驗室應加強與臨床醫(yī)師的溝通，及時指導臨床醫(yī)師選擇有價值的診斷項目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗結果；不斷接受正確合理的臨床醫(yī)師的反饋意見，及時了解臨床對個體化用藥分子檢測的需求，優(yōu)化項目目錄。實驗室應根據(jù)其具體的工作流程，確定質量監(jiān)測指標，如患者診斷信息完整率、適當臨床判斷率等，并定期對數(shù)據(jù)進行回顧性分析，定期對檢驗申請進行評審。2）患者的正確識別及知情同意患者的正確識別是確保獲得正確的臨床標本的前提。收集標本的容器上應注明患者的信息，通常應包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號等。醫(yī)護人員在采樣前需首先核對確定患者的身份，核實能標示患者的信息。標本收集前應向患者介紹個體化用藥基因檢測的意義，以得到患者的認同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測項目的目的、意義、基本過程、項目可能存在的不足如檢測結果可能出現(xiàn)與臨床用藥實際不相符的情況、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項目）及保存時間，保護受檢者的個人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）。對實施有創(chuàng)檢查的分子診斷項目如穿刺取活檢組織，應清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風險和緊急情況下的緊急預案。知情同意書是醫(yī)方履行如實告知義務的證據(jù)，也是患者行使選擇權的書面依據(jù)。3）送檢單的填寫與項目的復核標本采集前需填寫送檢申請單，提供受檢者必需的信息。申請單需填寫的信息包括：申請的檢測項目、標本編號、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時間、標本來源（組織類型）、相關臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實驗室應有專業(yè)人員根據(jù)信息采集表對檢測項目的合理性進行審核，必要時可與送檢醫(yī)師討論。2標本采集臨床分子診斷實驗室應對各種個體化用藥分子診斷臨床標本的采集按檢測要求建立SOP。標本采集人員應經(jīng)過系統(tǒng)的培訓。采樣前應對標本采集容器進行評價，確保容器本身不會干擾測定過程，并保存評估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標本在采集時間上無特殊要求。靜脈血液采集之前應按要求對預采血的部位徹底消毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標本即可，但用于RNA分析的標本需專門采集，并準備好液氮等速凍所需的材料及設備。標本采集需要在密閉、一次性采樣系統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應為一次性使用，以防止污染。無論采集哪種類型的標本，采樣時都必須戴手套，以避免標本中病原微生物感染和皮膚脫落細胞對標本的污染。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的標本類型有多種，包括全血標本、組織標本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。樣本采樣原則見《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》。1）全血和骨髓標本全血標本采集到含有適當抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測量（DNA、細胞內RNA）、檢測項目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓標本一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標注標本信息。全血標本采集外周靜脈血2~3mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測目的是細胞內RNA，建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標本時，可向無菌濾紙上滴加約50L全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個印圈上滴加標本，于室溫自然干燥至少4小時。干血斑標本采集時不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應放入無菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運送。2）組織標本當待檢測的組織與血液或口腔脫落細胞基因型不一致時，或當組織是待測核酸必須的來源時（如檢測腫瘤組織中mRNA表達、融合基因、基因擴增或缺失、甲基化水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標本進行檢測?？捎玫慕M織標本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無論是哪種組織類型，在沒有大量脂肪細胞侵潤的情況下，10mg組織標本可提取DNA或RNA10g。無菌條件下取米粒大小手術或活檢組織（約25mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比例>70％。穿刺取實體腫瘤組織時，取得的細胞數(shù)與穿刺針的粗細有關，21G細針每次獲得100個細胞，19G細針每次獲得150個細胞，支氣管活檢每次獲得300個細胞，CT介導的細針穿刺每次可獲得500個細胞。通常檢測時標本中腫瘤細胞的數(shù)量需達到200~400個。在某些情況下，要求同時采集無病變的組織或外周血作為對照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測）。組織塊取樣后的處理與保存見《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》。石蠟包埋組織：推薦用10％中性緩沖甲醛溶液固定組織標本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。甲醛介導的DNA損傷在固定3小時后明顯發(fā)生，且時間越長，DNA損傷越嚴重。因此推薦較小的組織（如活檢組織標本）固定6～12小時，較大的組織（如手術切除標本）固定6～48小時。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測，但在沒有其他標本可供選擇時，可考慮選擇沒有污染部分提取的RNA用于檢測，待測RNA序列的長度最好<130bp。組織標本切片時應特別注意避免標本間的交叉污染。組織切片：用于DNA檢測時，手術標本需提供10μm厚的石蠟切片4～8張，面積為成人拇指蓋大??；活檢穿刺標本提供10μm厚切片8～10張。所有切片均為白片。腫瘤組織切片應在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細胞及腫瘤細胞的數(shù)量是否足夠（一般要求>50％）、壞死組織比例<10％，并在對應的白片上畫出癌巢，對腫瘤細胞密集區(qū)域進行標注。DNA測序法要求腫瘤細胞至少占組織細胞的50％。應采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標本時，需更換新刀片。3）口腔脫落細胞口腔脫落細胞可同時用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進口腔，在口腔內側臉頰粘膜處左右反復擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內封閉并放入紙質信封，信封上應做好詳細標記。濾紙應經(jīng)過滅菌處理，以防細菌生長抑制核酸酶的活性。漱口標本也可作為口腔脫落細胞的來源。用于RNA分析的口腔脫落細胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。3標本的運輸與保存分子檢測人員應熟知標本運送與保存的條件要求。標本一經(jīng)采集，應盡快送到臨檢實驗室。臨檢實驗室應制定樣本運輸與保存的SOP。在運送工具的選擇、標本的運送和保存環(huán)境等方面應嚴格按規(guī)定執(zhí)行。運送過程中應防止盛放標本的容器破碎和標本丟失，注意標本的隔離、封裝、容器的密閉。標本應標明采集的日期和時間、運送時間、實驗室接收時間、實驗室接收時標本的溫度。運送條件根據(jù)標本類型和待測靶核酸的性質而定。DNA分析應在采集后8小時內送達實驗室，否則需低溫運送。當待測核酸為RNA時，能在10分鐘內送達實驗室的標本可室溫運送；如果運送時間較長，則應將標本置于干冰中，4小時內送達實驗室；如果標本中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運送或郵寄。標本的長距離運送應符合生物安全要求。標本運輸人員應接受適用于標本類型和遠程運輸?shù)陌踩桶b程序的培訓。1）樣本運輸中需注意的常規(guī)事項放置血液標本的采血管應用石蠟膜或透明膠帶封住管蓋，以防標本運送過程中采血管管蓋脫離；標本運輸過程中選用輕質且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細碎輕質材料填充。標本運輸和儲存過程中要避免將標本暴露于可能導致核酸降解的環(huán)境中。選擇可靠的快遞公司，樣本寄出后應盡快告知檢測實驗室快遞單號及相關信息，以便對樣本運輸情況進行查詢和跟蹤。樣本要求在盡量短的時間內送達臨檢實驗室。組織或血液標本的采集過程中可能引起部分基因的表達上調，定量分析基因表達時需考慮到。2）常見標本運輸和保存注意事項見《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》。4標本的接收與保存1）標本的驗收、接受與拒收：臨床分子診斷實驗室應建立嚴格的標本驗收制度和不合格標本拒收制度，并安排專人接收標本。標本驗收的內容包括：檢查申請單的項目填寫是否符合要求、標識是否清楚；申請單有無醫(yī)師簽字；申請單所填項目是否與標本所示一致；申請單姓名、科別、門診或住院號與標本的標簽是否一致；是否簽署了知情同意書；核實標本采集及送檢之間的時間間隔（要求采樣1周以內）；檢查標本的量和外觀質量，血液標本的外觀質量包括采血管是否密閉、有無溶血、管壁有無破損、標本是否有明顯的污染跡象（如開蓋），樣本接收時的大致溫度，樣本量是否符合要求。手術切除組織標本需做切片和HE染色，由有經(jīng)驗的病理醫(yī)師評價腫瘤細胞的數(shù)量是否滿足檢測需要。若送檢的為DNA樣本時，要求體積大于20μL，OD260/280為1.6~1.8之間，濃度大于50ng/μL，瓊脂糖電泳后電泳條帶大于50kb。拒收無標簽、標簽不清晰、采血管破裂、已開蓋、運送時間超過1周的樣本。拒收標本時應及時與送檢單位聯(lián)系，要求重新采樣或重新送樣。每個接受的合格標本均應分配一個唯一的標識碼。樣本簽收時實行送樣人和收樣人雙簽名制度。標本接收后，如不能立即檢測，必須按要求進行適當?shù)谋４妗?）樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基本信息，收樣日期和時間，并盡快將標本信息錄入實驗室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過程及樣本保存均用唯一編號。3）