藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析前質(zhì)量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析前質(zhì)量保證根據(jù)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的條件確定合適的分子診斷項(xiàng)目和恰當(dāng)?shù)臉颖咎幚硎谴_保核酸定性定量檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。標(biāo)本在檢測(cè)前必須確保標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存符合要求。標(biāo)本處置不當(dāng)可能引起核酸降解，導(dǎo)致定量檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。1采樣前準(zhǔn)備1）分子診斷項(xiàng)目的申請(qǐng)與完善藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)采樣前需填寫(xiě)規(guī)范的申請(qǐng)單，申請(qǐng)單應(yīng)包含足夠的信息，以識(shí)別患者和有資格開(kāi)具申請(qǐng)單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)臨床需求合理選擇分子診斷項(xiàng)目。個(gè)體化用藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)與臨床醫(yī)師的溝通，及時(shí)指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇有價(jià)值的診斷項(xiàng)目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗(yàn)結(jié)果；不斷接受正確合理的臨床醫(yī)師的反饋意見(jiàn)，及時(shí)了解臨床對(duì)個(gè)體化用藥分子檢測(cè)的需求，優(yōu)化項(xiàng)目目錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)其具體的工作流程，確定質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)，如患者診斷信息完整率、適當(dāng)臨床判斷率等，并定期對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，定期對(duì)檢驗(yàn)申請(qǐng)進(jìn)行評(píng)審。2）患者的正確識(shí)別及知情同意患者的正確識(shí)別是確保獲得正確的臨床標(biāo)本的前提。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者的信息，通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號(hào)等。醫(yī)護(hù)人員在采樣前需首先核對(duì)確定患者的身份，核實(shí)能標(biāo)示患者的信息。標(biāo)本收集前應(yīng)向患者介紹個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的意義，以得到患者的認(rèn)同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測(cè)項(xiàng)目的目的、意義、基本過(guò)程、項(xiàng)目可能存在的不足如檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實(shí)際不相符的情況、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項(xiàng)目）及保存時(shí)間，保護(hù)受檢者的個(gè)人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）。對(duì)實(shí)施有創(chuàng)檢查的分子診斷項(xiàng)目如穿刺取活檢組織，應(yīng)清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風(fēng)險(xiǎn)和緊急情況下的緊急預(yù)案。知情同意書(shū)是醫(yī)方履行如實(shí)告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者行使選擇權(quán)的書(shū)面依據(jù)。3）送檢單的填寫(xiě)與項(xiàng)目的復(fù)核標(biāo)本采集前需填寫(xiě)送檢申請(qǐng)單，提供受檢者必需的信息。申請(qǐng)單需填寫(xiě)的信息包括：申請(qǐng)的檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本編號(hào)、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時(shí)間、標(biāo)本來(lái)源（組織類型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專業(yè)人員根據(jù)信息采集表對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的合理性進(jìn)行審核，必要時(shí)可與送檢醫(yī)師討論。2標(biāo)本采集臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各種個(gè)體化用藥分子診斷臨床標(biāo)本的采集按檢測(cè)要求建立SOP。標(biāo)本采集人員應(yīng)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對(duì)標(biāo)本采集容器進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保容器本身不會(huì)干擾測(cè)定過(guò)程，并保存評(píng)估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本在采集時(shí)間上無(wú)特殊要求。靜脈血液采集之前應(yīng)按要求對(duì)預(yù)采血的部位徹底消毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標(biāo)本即可，但用于RNA分析的標(biāo)本需專門(mén)采集，并準(zhǔn)備好液氮等速凍所需的材料及設(shè)備。標(biāo)本采集需要在密閉、一次性采樣系統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染。無(wú)論采集哪種類型的標(biāo)本，采樣時(shí)都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)胞對(duì)標(biāo)本的污染。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本類型有多種，包括全血標(biāo)本、組織標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。樣本采樣原則見(jiàn)《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》。1）全血和骨髓標(biāo)本全血標(biāo)本采集到含有適當(dāng)抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測(cè)量（DNA、細(xì)胞內(nèi)RNA）、檢測(cè)項(xiàng)目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓標(biāo)本一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標(biāo)注標(biāo)本信息。全血標(biāo)本采集外周靜脈血2~3mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測(cè)目的是細(xì)胞內(nèi)RNA，建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標(biāo)本時(shí)，可向無(wú)菌濾紙上滴加約50L全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個(gè)印圈上滴加標(biāo)本，于室溫自然干燥至少4小時(shí)。干血斑標(biāo)本采集時(shí)不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無(wú)菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時(shí)加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運(yùn)送。2）組織標(biāo)本當(dāng)待檢測(cè)的組織與血液或口腔脫落細(xì)胞基因型不一致時(shí)，或當(dāng)組織是待測(cè)核酸必須的來(lái)源時(shí)（如檢測(cè)腫瘤組織中mRNA表達(dá)、融合基因、基因擴(kuò)增或缺失、甲基化水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)?？捎玫慕M織標(biāo)本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無(wú)論是哪種組織類型，在沒(méi)有大量脂肪細(xì)胞侵潤(rùn)的情況下，10mg組織標(biāo)本可提取DNA或RNA10g。無(wú)菌條件下取米粒大小手術(shù)或活檢組織（約25mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比例>70％。穿刺取實(shí)體腫瘤組織時(shí)，取得的細(xì)胞數(shù)與穿刺針的粗細(xì)有關(guān)，21G細(xì)針每次獲得100個(gè)細(xì)胞，19G細(xì)針每次獲得150個(gè)細(xì)胞，支氣管活檢每次獲得300個(gè)細(xì)胞，CT介導(dǎo)的細(xì)針穿刺每次可獲得500個(gè)細(xì)胞。通常檢測(cè)時(shí)標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量需達(dá)到200~400個(gè)。在某些情況下，要求同時(shí)采集無(wú)病變的組織或外周血作為對(duì)照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)）。組織塊取樣后的處理與保存見(jiàn)《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》。石蠟包埋組織：推薦用10％中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3小時(shí)后明顯發(fā)生，且時(shí)間越長(zhǎng)，DNA損傷越嚴(yán)重。因此推薦較小的組織（如活檢組織標(biāo)本）固定6～12小時(shí)，較大的組織（如手術(shù)切除標(biāo)本）固定6～48小時(shí)。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測(cè)，但在沒(méi)有其他標(biāo)本可供選擇時(shí)，可考慮選擇沒(méi)有污染部分提取的RNA用于檢測(cè)，待測(cè)RNA序列的長(zhǎng)度最好<130bp。組織標(biāo)本切片時(shí)應(yīng)特別注意避免標(biāo)本間的交叉污染。組織切片：用于DNA檢測(cè)時(shí)，手術(shù)標(biāo)本需提供10μm厚的石蠟切片4～8張，面積為成人拇指蓋大??；活檢穿刺標(biāo)本提供10μm厚切片8～10張。所有切片均為白片。腫瘤組織切片應(yīng)在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否足夠（一般要求>50％）、壞死組織比例<10％，并在對(duì)應(yīng)的白片上畫(huà)出癌巢，對(duì)腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注。DNA測(cè)序法要求腫瘤細(xì)胞至少占組織細(xì)胞的50％。應(yīng)采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標(biāo)本時(shí)，需更換新刀片。3）口腔脫落細(xì)胞口腔脫落細(xì)胞可同時(shí)用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理，以防細(xì)菌生長(zhǎng)抑制核酸酶的活性。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來(lái)源。用于RNA分析的口腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。3標(biāo)本的運(yùn)輸與保存分子檢測(cè)人員應(yīng)熟知標(biāo)本運(yùn)送與保存的條件要求。標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送到臨檢實(shí)驗(yàn)室。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本運(yùn)輸與保存的SOP。在運(yùn)送工具的選擇、標(biāo)本的運(yùn)送和保存環(huán)境等方面應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)防止盛放標(biāo)本的容器破碎和標(biāo)本丟失，注意標(biāo)本的隔離、封裝、容器的密閉。標(biāo)本應(yīng)標(biāo)明采集的日期和時(shí)間、運(yùn)送時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)標(biāo)本的溫度。運(yùn)送條件根據(jù)標(biāo)本類型和待測(cè)靶核酸的性質(zhì)而定。DNA分析應(yīng)在采集后8小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，否則需低溫運(yùn)送。當(dāng)待測(cè)核酸為RNA時(shí)，能在10分鐘內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本可室溫運(yùn)送；如果運(yùn)送時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)將標(biāo)本置于干冰中，4小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；如果標(biāo)本中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運(yùn)送或郵寄。標(biāo)本的長(zhǎng)距離運(yùn)送應(yīng)符合生物安全要求。標(biāo)本運(yùn)輸人員應(yīng)接受適用于標(biāo)本類型和遠(yuǎn)程運(yùn)輸?shù)陌踩桶b程序的培訓(xùn)。1）樣本運(yùn)輸中需注意的常規(guī)事項(xiàng)放置血液標(biāo)本的采血管應(yīng)用石蠟?zāi)せ蛲该髂z帶封住管蓋，以防標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中采血管管蓋脫離；標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中選用輕質(zhì)且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細(xì)碎輕質(zhì)材料填充。標(biāo)本運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中要避免將標(biāo)本暴露于可能導(dǎo)致核酸降解的環(huán)境中。選擇可靠的快遞公司，樣本寄出后應(yīng)盡快告知檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室快遞單號(hào)及相關(guān)信息，以便對(duì)樣本運(yùn)輸情況進(jìn)行查詢和跟蹤。樣本要求在盡量短的時(shí)間內(nèi)送達(dá)臨檢實(shí)驗(yàn)室。組織或血液標(biāo)本的采集過(guò)程中可能引起部分基因的表達(dá)上調(diào)，定量分析基因表達(dá)時(shí)需考慮到。2）常見(jiàn)標(biāo)本運(yùn)輸和保存注意事項(xiàng)見(jiàn)《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》。4標(biāo)本的接收與保存1）標(biāo)本的驗(yàn)收、接受與拒收：臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)本驗(yàn)收制度和不合格標(biāo)本拒收制度，并安排專人接收標(biāo)本。標(biāo)本驗(yàn)收的內(nèi)容包括：檢查申請(qǐng)單的項(xiàng)目填寫(xiě)是否符合要求、標(biāo)識(shí)是否清楚；申請(qǐng)單有無(wú)醫(yī)師簽字；申請(qǐng)單所填項(xiàng)目是否與標(biāo)本所示一致；申請(qǐng)單姓名、科別、門(mén)診或住院號(hào)與標(biāo)本的標(biāo)簽是否一致；是否簽署了知情同意書(shū)；核實(shí)標(biāo)本采集及送檢之間的時(shí)間間隔（要求采樣1周以內(nèi)）；檢查標(biāo)本的量和外觀質(zhì)量，血液標(biāo)本的外觀質(zhì)量包括采血管是否密閉、有無(wú)溶血、管壁有無(wú)破損、標(biāo)本是否有明顯的污染跡象（如開(kāi)蓋），樣本接收時(shí)的大致溫度，樣本量是否符合要求。手術(shù)切除組織標(biāo)本需做切片和HE染色，由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否滿足檢測(cè)需要。若送檢的為DNA樣本時(shí)，要求體積大于20μL，OD260/280為1.6~1.8之間，濃度大于50ng/μL，瓊脂糖電泳后電泳條帶大于50kb。拒收無(wú)標(biāo)簽、標(biāo)簽不清晰、采血管破裂、已開(kāi)蓋、運(yùn)送時(shí)間超過(guò)1周的樣本。拒收標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)與送檢單位聯(lián)系，要求重新采樣或重新送樣。每個(gè)接受的合格標(biāo)本均應(yīng)分配一個(gè)唯一的標(biāo)識(shí)碼。樣本簽收時(shí)實(shí)行送樣人和收樣人雙簽名制度。標(biāo)本接收后，如不能立即檢測(cè)，必須按要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４妗?）樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基本信息，收樣日期和時(shí)間，并盡快將標(biāo)本信息錄入實(shí)驗(yàn)室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過(guò)程及樣本保存均用唯一編號(hào)。3）