藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質量保證藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的質量控制與保證是個體化醫(yī)學檢測質量保證的核心內容，是個體化用藥基因診斷規(guī)范化和標準化的首要前提。因此臨床檢驗項目的計劃和準備，試驗性能確認/驗證以及檢驗全過程都需要建立有效的質量控制體系。1檢測確認和特征描述在將檢測用于臨床工作之前應該對方法進行分析確認和臨床確認。實驗室應確定待檢測的靶核酸、確定要使用的試驗方法和建立試驗性能確認/驗證的計劃和程序。確認/驗明程序應該包括：檢驗目的；靶基因，基因序列和突變；預期患者人群；被比較的試驗方法，或要使用的方法；使用的樣本類型；要確定的分析性能特征；參考材料的來源；如何分析性能規(guī)范，如何規(guī)定試驗的局限性；出現(xiàn)問題時的糾正措施。2可操作性的SOP編寫有可操作性的標準操作規(guī)程（SOP）是個體化醫(yī)學檢測實驗室質量管理的靈魂。SOP源于儀器和試劑說明書、一些標準文件和實驗室實驗工作經驗的積累，應包括試劑準備、標本采集、標本接收與預處理、核酸提取、測定方法、結果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的各個環(huán)節(jié)。SOP的編寫應注意通俗易懂、注重細節(jié)、清晰明了、圖文并茂。實驗室工作人員應嚴格遵循SOP中的步驟要求進行操作，當發(fā)現(xiàn)SOP有“故障”時，經過技術研發(fā)小組的工作人員討論、實驗驗證后及時修改。3質控品與室內質控3.1質控品所有藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測都需要選擇一定的質控樣本進行質控分析。質控樣本的選擇視檢測項目而定，如藥物代謝酶的SNP檢測的陰性質控樣本可以是無相關突變的同類樣本和不含任何核酸的水樣本，陽性質控樣本可以為以前檢測過的特定基因突變已知的樣本或體外構建的已含特定突變質粒的細胞株。常用的做法為：在每次檢測時同時設立試劑對照、陰性質控、陽性質控、弱陽性質控，且這些質控樣本與待檢樣本同時進行檢測，每隔一定數(shù)量的臨床標本插入一份質控樣本。當同時檢測多個變異位點時，可根據(jù)實驗室的條件設立針對2～3個位點的陰性或陽性對照，但不同批次間要注意更換陰性和陽性對照樣品。質控樣本的質量與實驗結果的可信度密切相關。理想的室內質控樣本應該具有以下特點：基質一致，即與待測樣本具有相同的基質；穩(wěn)定性好，在適當?shù)膬Υ鏃l件下能保持較好的穩(wěn)定性；檢測結果應該是確定的，且越接近試驗的決定性水平越好；具有安全性，不得有生物傳染危險性；單批可大量獲得，以便于長期連續(xù)監(jiān)測。3.2室內質量控制的方法應用統(tǒng)計學原理或非統(tǒng)計學方法判斷測定批次的結果是失控還是在控，是室內質控的核心。室內質量控制的方法包括統(tǒng)計學質量控制和非統(tǒng)計學質量控制兩大類。一般而言，定性檢測（如基因分型）采用非統(tǒng)計學質量控制，而定量檢測如基因表達水平檢測、基因甲基化水平測定、以及實驗室“污染”所致的假陽性定量檢測一般采用統(tǒng)計學質控。統(tǒng)計學質控主要從不精密度和偏離度兩個方面確定檢測程序或分析方法穩(wěn)定性的性能特點，其具體做法是在常規(guī)檢測臨床標本時，除陰性質控外，還要對連續(xù)的一個濃度梯度的陽性質控樣本進行檢測，分析判斷質控樣本的測定結果是否偏出所用方法的測定范圍，進而決定常規(guī)臨床測定標本結果的有效性。統(tǒng)計學質量控制的前提是制定在最佳條件和常規(guī)條件下實驗室變異的基線。在進行不精密度測定時，一般至少對20個不同的樣本連續(xù)檢測不少于20天，每天2次。偏離度的測定可采用基準線法、與參考物質的檢測結果比較、與其他平行單位的檢測結果比較、與其他檢測方法的檢測結果比較等多種方法。部分定性檢測方法因可計算出樣本中突變等位基因的比例，也可應用統(tǒng)計學質控方法進行質控分析。統(tǒng)計學質量控制方法主要包括兩大類：陽性樣本測定重復性統(tǒng)計質控方法和假陽性的統(tǒng)計質控方法。陽性質控品測定重復性統(tǒng)計能較準確的反映實驗室儀器、試劑、實驗員操作的穩(wěn)定性，也是實驗室實時監(jiān)控檢測結果是否可信的重要手段，其主要統(tǒng)計控制方法包括基線測定、Levey-Jennings質控圖方法、Westgard多規(guī)則質控方法、累積和（CUSUM）質控方法及“即刻法”質控方法。假陽性的統(tǒng)計質控方法包括根據(jù)日常患者結果陽性率的Levey-Jennings質控圖和直接概率計算法兩種，其中Levey-Jennings質控圖法是目前臨床檢驗中應用較為廣泛的一種方法，適合于質控樣本多次重復、檢測結果可用數(shù)值表示且呈正態(tài)分布的情況。Levey-Jennings質控圖法的具體做法是：樣本處理（核酸提取）時加入流程陰參，所有步驟與待測樣本一致；加模板時，各檢測位點均應設置陰性對照（即以流程陰參為模板，用于檢測是否發(fā)生“污染”）與一定比例的突變型/野生型陽性標準品[23]。PCR擴增時注意前后批次陰參和陽參的孔槽擺放位置的隨機性。所有陰參、陽參的檢測結果應符合預期值，記錄各個陽性質控品PCR擴增產物檢測結果。用Levey-Jennings質控圖進行統(tǒng)計分析，根據(jù)質控規(guī)則判斷檢測結果是否在控。質控規(guī)則如下：12S：1個質控測定值超出X±2S控制線，預警。13S：1個質控測定值超出X±3S控制線，失控。22S：同一批次2個連續(xù)的質控測定值或不同批次的2個質控測定值同時超出X+2S或X-2S控制線，失控。R4S：同一批測定中，2個不同濃度質控物的測定值之間的差值超出4S控制線，失控。41S:4個連續(xù)的質控測定值同時超出X+1S或X-1S控制線，失控。7T：7個連續(xù)的質控測定值呈現(xiàn)出向上或向下的趨勢，失控。10X：10個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（X）的同一側，失控。只有當使用所有質控規(guī)則判斷確定測定值在控時的檢測結果方為可信結果，而只要上述質控規(guī)則之一判斷測定值失控即認為該測定值失控。陰參檢測結果為陽性，也判定為失控。一旦失控出現(xiàn)，當日所有檢測結果無效，必須暫停實驗并及時查明原因，采取改進措施，直至測定結果在控后方可重新開始臨床檢測。每次出現(xiàn)失控情況需填寫失控記錄，詳細記錄失控原因、采取措施及其效果，失控報告應及時通報公布，以免反復出現(xiàn)同一原因導致的失控。4室內質量控制的評價實驗室應有專人對實驗過程各個階段及實驗數(shù)據(jù)進行質檢。在日常臨床診斷服務過程中，如果發(fā)現(xiàn)陽性質控標本結果偏高、偏低或陰性，或陰性質控品檢測為陽性，則應立刻查找失控原因，并采取預防措施。陽性質控品失控常見的原因包括模板問題、引物或探針問題、儀器問題或試劑問題。應對策略包括：純化核酸、高濃度小量分裝、避免核酸反復凍融；換用新的檢測試劑；標本重復雙份測定；對可能含PCR擴增抑制物的標本進行稀釋等。陰性質控品呈陽性提示核酸“污染”，污染來源可能是擴增產物和（或）核酸提取過程中的交叉污染。如果臨檢標本全都陽性，提示擴增產物或試劑污染，應更換試劑或進行實驗室清潔、通風；如果臨檢標本部分陽性、部分陰性，考慮為擴增產物輕度污染或標本間交叉污染，可通過對5～8份水樣品進行檢測，查明污染來源，陽性提示實驗室污染，則應進行實驗室清潔、通風，陰性要提醒臨檢人員注意操作過程。5室間質量評價臨床檢測實驗室應參加室間質量評價（EQA），對待EQA樣本不能特殊化，詳細、如實地記錄參與EQA的全過程，根據(jù)反饋結果了解本實驗室的能力、自查存在的問題，及時尋求改進方法，解決問題，完善實驗室質量控制體系，以促進實驗室更好的發(fā)展。EQA評分包括絕對評分和相對評分。絕對評分就是看實驗室對該次所有質評樣本檢測結果與預期結果相符的標本總數(shù)占該次全部樣本的百分比，大部分項目大于80%即可視為檢測結果滿意或合格。藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測的EQA還需對檢測報告的填寫規(guī)范程度、文字錯誤、報告清晰度、結