生物技術(shù)-基因工程篇

生物技術(shù)之

——基因工程篇基因工程(geneticengineering)基因工程又稱DNA重組技術(shù)，即在體外把兩種或者兩種以上不同來(lái)源的DNA分子重新組合成新的DNA分子，通過(guò)載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，將所需要的經(jīng)過(guò)修飾的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生人類所需要的基因或產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)基因生物?；蚬こ痰幕静襟E分離/制備目的基因選擇載體使目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體以重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（細(xì)菌或其他細(xì)胞）篩選出能夠表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞，使這些細(xì)胞擴(kuò)增、繁殖獲得大量拷貝的目的基因使目的基因在宿主細(xì)胞表達(dá)出編碼的多肽基因工程（原核表達(dá)系統(tǒng)）操作的基本步驟一、目標(biāo)基因的制備1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法3、人工合成法4、通過(guò)PCR把目的基因擴(kuò)增出來(lái)1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）基因組文庫(kù)（genomiclibrary）cDNA文庫(kù)文庫(kù)（cDNAlibrary）用合適的探針通過(guò)分子雜交，從基因庫(kù)中分離出含有特定基因的克隆mRNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄3、人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列※用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因核苷酸序列化學(xué)合成目的基因按密碼子推算

利用化學(xué)合成法已成功合成人生長(zhǎng)激素釋放因子、胸腺素、血管升壓素、胰島素、α干擾素等基因，并進(jìn)一步生產(chǎn)出相應(yīng)的藥物。4、通過(guò)PCR把目的基因擴(kuò)增出來(lái)

外源目的DNA一般缺乏直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞和進(jìn)行DNA復(fù)制的能力，不能在宿主細(xì)胞表達(dá)，必須依賴適當(dāng)?shù)妮d體分子。二、載體的選擇

載體（vector）：運(yùn)載外源性DNA有效地進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)的工具。

1、

載體應(yīng)具備的條件①是單個(gè)復(fù)制單元，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制自身。②分子相對(duì)較?。?~10kb），以便從細(xì)胞中分離純化。③含有多種限制性內(nèi)切酶單一切點(diǎn)，酶切位點(diǎn)應(yīng)在復(fù)制子以外適當(dāng)?shù)奈恢?。④能接納盡可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，載體在受體細(xì)胞中的復(fù)制不受影響。⑤必須有便于篩選的明顯標(biāo)志，如耐藥性和空斑形成等,以便于陽(yáng)性克隆細(xì)胞容易被選出⑥對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。⑦有促進(jìn)外源性DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)；

※天然載體有很多缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想載體的要求，通常使用的載體都是經(jīng)過(guò)改造過(guò)的載體。質(zhì)粒（plasmid）噬菌體（phage）病毒(vector)

2、載體的種類按來(lái)源分

克隆載體(cloningvector)按作用分表達(dá)載體(expressionvector)（1）質(zhì)粒載體存在于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀小型DNA分子。質(zhì)粒的存在與否一般對(duì)細(xì)菌的生存沒(méi)有決定性的影響。帶有選擇性遺傳標(biāo)志，如基因的產(chǎn)物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）。

質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制有兩種類型嚴(yán)密型質(zhì)粒：復(fù)制需要蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在，它的復(fù)制與宿主細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)只有1~5個(gè)嚴(yán)密型質(zhì)粒。

松弛型質(zhì)粒：復(fù)制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在沒(méi)有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)可存有10~200個(gè)以上的松弛型質(zhì)粒，在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色質(zhì)復(fù)制停止的情況下，可繼續(xù)大量擴(kuò)增至上千份。

利用此原理可在質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成，達(dá)到進(jìn)一步擴(kuò)增松弛型質(zhì)粒的目的。

實(shí)際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322,pUC19等。PBR322抗氨芐青基因抗四環(huán)素基因4363bp質(zhì)粒攜帶外源基因1）λ噬菌體（2）噬菌體載體感染細(xì)菌的病毒a.λ噬菌體的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形），兩端具有12個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)的粘性末端。當(dāng)λ噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈線狀DNA分子立即通過(guò)粘性末端互補(bǔ)連接，封閉成環(huán)。這個(gè)粘性末端結(jié)合的部位稱為COS位點(diǎn)（cohesiveendsite）。?具非必需區(qū)/非生活區(qū)（中間區(qū)約1/3長(zhǎng)度），此區(qū)可通過(guò)遺傳工程技術(shù)由外源性的DNA所代替。b.λ噬菌體感染細(xì)菌后有兩種生活途徑

溶菌性

在細(xì)菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂解，釋放噬菌體。

溶源性將其DNA整合入細(xì)菌基因組DNA中，與宿主DNA一起復(fù)制，然后傳給子代，宿主細(xì)胞不發(fā)生裂解。只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。噬菌體的溶源周期和溶菌周期c.λ噬菌體作為基因克隆載體的幾點(diǎn)好處?可在體外包裝成病毒顆粒，可高效感染宿主細(xì)胞（大腸桿菌）?容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。?重組的λ噬菌體容易篩選，也容易保存。d.不利處λ噬菌體上有過(guò)多的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，因此必須對(duì)野生型λ噬菌體進(jìn)行改造，除去基因組“生活區(qū)”的酶切位點(diǎn)，而有目的的在“非生活區(qū)”保留1～

2個(gè)酶切位點(diǎn)，以滿足構(gòu)建重組載體的需要。e.經(jīng)過(guò)改造構(gòu)建后的λ噬菌體載體有兩類

插入型載體：只有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供插入外源性DNA片段。替代型載體：含有某個(gè)限制性內(nèi)切酶的兩個(gè)切點(diǎn)，這兩個(gè)切點(diǎn)間的片段可以被外源性DNA替代。2）M13噬菌體（M13phage）a.M13噬菌體基因的結(jié)構(gòu)及生活史特點(diǎn)單鏈線性DNA分子，長(zhǎng)約6500個(gè)核苷酸；感染大腸桿菌后，單鏈線性DNA分子可轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從大腸桿菌中分離出雙鏈復(fù)制型的M13還可作為克隆雙鏈DNA的載體；大腸桿菌被感染后，并不死亡，只是生長(zhǎng)緩慢，而新的噬菌體被釋放到菌體外?；蚪M中有一段長(zhǎng)約507個(gè)核苷酸的非必需區(qū)(IS)，可以插入外源性DNA。b.M13噬菌體作為基因克隆載體的優(yōu)點(diǎn)從宿主菌體中釋放出來(lái)的M13噬菌體粒子只含單鏈DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中兩條中的一條，因此可用來(lái)制備單鏈DNA探針，也可以用作DNA測(cè)序的模板。c.對(duì)M13噬菌體的改造

野生型M13噬菌體的非必需區(qū)中沒(méi)有常用內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。因此，用作載體的M13均是經(jīng)過(guò)一系列改造后而構(gòu)建的，如M13mp2、mp5、mp7、mp9、mp18、mp19。

具體的改造方法是在野生型M13DNA中人工插入兩個(gè)核苷酸順序：

大腸桿菌乳糖操縱子中的控制區(qū)和β-半乳糖苷酶基因（Z基因）。

如果在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（x-gal，為一種色原），由IPTG誘導(dǎo)而產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以使x-gal水解，產(chǎn)生藍(lán)色化合物/藍(lán)色噬菌斑。

插入50bp長(zhǎng)的一小段DNA順序，稱為多接頭（polylinker）。在這個(gè)接頭中約有10多種內(nèi)切酶割切位點(diǎn)。由于多接頭區(qū)位于β-半乳糖苷酶基因中，所以，當(dāng)外源性DNA片段克隆到多接頭處任何一個(gè)切割位點(diǎn)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌就不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，從而在含有IPTG和x-gal的培養(yǎng)基中產(chǎn)生無(wú)色噬菌斑。

是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。

由入噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。

在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。（3）粘尾質(zhì)粒(cosmid)/粘性質(zhì)粒/粘粒/cos質(zhì)粒cosmid的構(gòu)造特點(diǎn):

含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位；

一個(gè)或多個(gè)單一酶的限制位點(diǎn)；

帶有入噬菌體粘性末端；

分子小，可容納大的外源DNA片段。將染色體端粒序列（TEL）、自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒（CEN）以及必要的選擇標(biāo)記（HISA4和TRP）基因和多克隆位點(diǎn)（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞YAC。1）酵母為宿主的載體（4）真核細(xì)胞為宿主的克隆載體人工構(gòu)建的酵母質(zhì)粒

酵母人工微小染色體（YAC）2）以植物細(xì)胞為宿主的基因克隆載體Ti質(zhì)粒是根瘤土壤桿菌內(nèi)的質(zhì)粒，對(duì)其改造可構(gòu)建成在植物細(xì)胞克隆或表達(dá)的載體。3）DNA病毒載體——理想的動(dòng)物細(xì)胞基因工程載體SV40載體（猴腎病毒）完整的SV40載體利用SV40元件組建的穿梭質(zhì)粒載體，如pSVK3質(zhì)粒：由噬菌體三種載體構(gòu)建而成質(zhì)粒SV40乳頭瘤病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。腺病毒載體

克隆載體(cloningvector)用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。

表達(dá)載體(expressionvector)在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體,除克隆載體的特性外還含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等。三、目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體

工具酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

能識(shí)別DNA分子內(nèi)部的特異的對(duì)稱序列,水解磷酸酯鍵，切斷分子,水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5′端為P，3′端為—OH。

識(shí)別序列的特點(diǎn)

①專一；②常由4~6個(gè)堿基組成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-

限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。到目前為止已發(fā)現(xiàn)上千種限制性內(nèi)切酶，其中數(shù)十種被經(jīng)常使用。限制酶的命名

EcoRⅠ細(xì)菌的屬名從該細(xì)菌中分離出的第幾個(gè)酶細(xì)菌種名細(xì)菌株系切口類型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCCDNA連接酶(DNAligase)目的基因受體細(xì)胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞※受體細(xì)胞必須是限制性內(nèi)切酶缺陷型，使載體或重組DNA不被水解四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

細(xì)菌細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、增代時(shí)間短、價(jià)格低廉；

某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平很高

缺點(diǎn):表達(dá)多肽分子常不能適當(dāng)?shù)卣郫B,蛋白質(zhì)常無(wú)生物活性；

異體蛋白質(zhì)，常對(duì)細(xì)菌有毒性作用；

缺乏真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，例如使蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化

1、化學(xué)轉(zhuǎn)化法

受體細(xì)胞經(jīng)一定的化學(xué)作用后，細(xì)胞膜通透性增加，處于感受態(tài)，稱之為感受態(tài)細(xì)胞（Competentcells）。Cacl2法：受體菌（如大腸桿菌

E-coli）在低溫下（0℃）被置于低滲的Cacl2溶液中，菌體膨脹成球形。轉(zhuǎn)化體系中的DNA與Ca2+形成羥基鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面，之后細(xì)菌經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，此時(shí)受體菌可大量吸收其表面粘附的DNA復(fù)合物，完成轉(zhuǎn)化，繼而在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一定時(shí)間（數(shù)小時(shí)）后，菌體恢復(fù)原狀，并可以分裂增殖。2、物理轉(zhuǎn)化法電穿孔法把受體細(xì)胞懸浮到含有轉(zhuǎn)移DNA的的平衡液中，加上瞬間高壓脈沖電，使細(xì)胞膜和核膜的通透性改變，一些DNA分子可以進(jìn)入受體核內(nèi)而被表達(dá)。微量注射法用微玻璃管通過(guò)顯微操作直接把純化的DNA注入到受體細(xì)胞內(nèi)。3、轉(zhuǎn)染用噬菌體或真核生物的病毒作為載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞常成為轉(zhuǎn)染。4、電泳、雙酶切、測(cè)序驗(yàn)證五、篩選出能夠表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞1、根據(jù)載體抗生素抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子