TCIFST 017-2023 葡萄球菌腸毒素測定 ELISA試劑盒法

ⅠT/CIFST017—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位:北京市疾病預(yù)防控制中心、中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所、澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司、北京三元食品股份有限公司、拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售(北京)有限公司。廖冰君。1T/CIFST017—2023葡萄球菌腸毒素測定ELISA試劑盒法1范圍本文件規(guī)定了食品及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中葡萄球菌腸毒素測定的酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒方法。本文件適用于食品及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中葡萄球菌腸毒素及其分型的定性測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.10食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3方法原理樣品中游離的葡萄球菌腸毒素(抗原)與微孔中包被的抗體特異性結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物。將未與抗體結(jié)合的物質(zhì)充分洗去,用酶標記物進行標記,在酶反應(yīng)底物/發(fā)色劑的作用下,微孔中的液體由無色變?yōu)樗{色。反應(yīng)結(jié)束后,加入終止液終止反應(yīng),這時微孔中的液體由藍色變?yōu)辄S色。使用酶標儀[(450nm±10nm)/(620nm±10nm)]測量微孔溶液的吸光度,樣品中葡萄球菌腸毒素含量與吸光度成正比。4設(shè)備和材料4.1葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒RIDASCREENSETTotal(見附錄A)。4.2葡萄球菌腸毒素分型檢測試劑盒RIDASCREENSETA、B、C、D、E(見附錄B)。4.3酶標儀:(450nm±10nm)/(620nm±10nm)。4.4分析天平:感量0.01g。4.5均質(zhì)器/振蕩器。4.6培養(yǎng)箱:37℃±1℃。4.7冷凍離心機:≥3500r/min,≤10℃。4.8離心管50mL:玻璃或聚丙烯材質(zhì)。4.9單道移液器:20μL~200μL,100μL~1000μL。4.10八道移液器:30μL~300μL。4.11冰箱:冷藏5℃±3℃,冷凍≤-18℃。4.12pH計:25℃條件下精度為0.01。4.13無菌濾膜:0.22μm。2T/CIFST017—20234.14無菌注射器:10mL。5試劑和培養(yǎng)基5.1實驗用水:符合GB/T6682規(guī)定的三級水要求。5.2PBS緩沖液:8.70gNaCl、0.55gNaH2PO4·H2O、2.85gNa2HPO4·2H2O,用水定容至1L,調(diào)pH至7.4。5.31×洗滌緩沖液:按照1∶10比例稀釋10×洗滌緩沖液濃縮液。稀釋后的1×洗滌緩沖液可在2℃~8℃保存1周。若10×洗滌緩沖液濃縮液稀釋前有結(jié)晶,需在37℃水浴鍋中加熱至完全溶解后再配置。5.4正庚烷:分析純。5.5腦心浸液培養(yǎng)基(BHI):10.0g胰蛋白胨、2.0g葡萄糖、5.0g牛心粉、5.0g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鈉(12H2O),用水定容至1L,加熱煮沸至完全溶解,分裝試管,121℃高壓滅菌15min備用。6檢測程序N葡萄球菌腸毒素檢測程序見圖1。NFS799)8")99)852"99)852"F5*KU&-*4"U99)852"4圖1葡萄球菌腸毒素檢測程序7操作步驟7.1樣品前處理7.1.1食品樣品7.1.1.1液態(tài)樣品(如生鮮乳、巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、飲料等)充分混勻待檢樣品,吸取樣品10mL~25mL,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進行檢測,并將待檢樣品的pH控制在7.0±0.5范圍內(nèi)。7.1.1.2粉狀樣品(如嬰幼兒配方粉、乳粉、調(diào)制乳粉、食品原料等)3T/CIFST017—2023充分混勻待檢樣品,稱取10g~25g進行均質(zhì)之后稱取1g加入10mL無菌蒸餾水,漩渦混勻,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進行檢測(結(jié)果以溶解后的液體計),并將待檢樣品的pH控制在7.0±0.5范圍內(nèi)。7.1.1.3脂肪含量小于40%的樣品(如米、面及其制品,豆制品等)充分混勻待檢樣品,稱取10g~25g均質(zhì)后按每克樣品加入1.5mLPBS緩沖液的比例(例如10g樣品+15mLPBS緩沖液),振蕩混合15min,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進行檢測。7.1.1.4脂肪含量大于等于40%的樣品(如肉制品等)充分混勻待檢樣品,稱取10g~25g均質(zhì)后按每克樣品加入1.5mLPBS緩沖液的比例(例如10g樣品+15mLPBS緩沖液),振蕩混合15min,3500r/min10℃離心10min,取一定量上清液移至另一個離心管中,加入與所取上清液相同體積的正庚烷,充分混合5min,3500r/min10℃離心10min,完全去除上層庚烷層,取下層清液進行檢測。7.1.2金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液將純培養(yǎng)的待測金黃色葡萄球菌接種于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)過夜培養(yǎng)。取1.5mL~2mL培養(yǎng)液置于離心管中,3500r/min10℃離心5min,將上清液用無菌注射器和無菌濾膜過濾除菌,取濾液進行檢測。7.2葡萄球菌腸毒素檢測7.2.1將預(yù)先包被有葡萄球菌腸毒素特異性抗體的微孔條(見附錄A)插入微孔板架(見附錄A),標記樣品液、陰性質(zhì)控液(見附錄A)和陽性質(zhì)控液(見附錄A)的位置。7.2.2在相應(yīng)的微孔中分別加入100μL處理好的樣品液、陰性質(zhì)控液及陽性質(zhì)控液。蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.2.3取出微孔板,倒去微孔中的液體,每個微孔加入300μL1×洗滌緩沖液洗滌,混合靜置后倒去洗滌液,拍干微孔板(力度適中)。重復(fù)上述步驟5次(可由自動洗板機完成)。7.2.4洗板后,每個微孔加入100μL酶標記物1溶液(見附錄A),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.2.5取出微孔板,進行第2次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.6洗板后,每個微孔加入100μL酶標記物2溶液(見附錄A),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育30min。7.2.7取出微孔板,進行第3次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.8洗板后,每個微孔加入100μL底物/發(fā)色劑(見附錄A),水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,蓋上微孔板,35℃~37℃避光孵育15min。7.2.9取出微孔板,每個微孔加入100μL終止液,水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,30min之內(nèi)讀取(450nm±10nm)/(620nm±10nm)波長下吸光度(OD)。7.3葡萄球菌腸毒素分型檢測7.3.1將預(yù)先包被有抗體的微孔板條(見附錄B)按照A—H的方向插入微孔板架(見附錄B),每一件待測樣品使用一條微孔板條。7.3.2在微孔板條A~G孔中各加入100μL處理好的樣品液,在H孔加入100μL陽性質(zhì)控液(見附錄B),輕輕混勻后,蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.3.3取出微孔板,倒去微孔中的液體,每個微孔加入300μL1×洗滌緩沖液洗滌,混合靜置后倒去洗滌液,拍干微孔板(力度適中)。重復(fù)上述步驟5次(可由自動洗板機完成)。7.3.4洗板后,每個微孔加入100μL酶標記物1溶液(見附錄B),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。4T/CIFST017—20237.3.5取出微孔板,進行第2次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.6洗板后,每個微孔加入100μL酶標記物2溶液(見附錄B),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育30min。7.3.7取出微孔板,進行第3次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.8洗板后,每個微孔加入100μL底物/發(fā)色劑(見附錄B),水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,蓋上微孔板,35℃~37℃避光孵育15min。7.3.9取出微孔板,每個微孔加入100μL終止液,水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,30min之內(nèi)讀取(450nm±10nm)/(620nm±10nm)波長下吸光度(OD)。8結(jié)果與報告8.1檢測有效性判定陽性質(zhì)控孔的吸光度(OD)應(yīng)≥1.0,陰性質(zhì)控孔的吸光度(OD)應(yīng)≤0.2,如果不能同時滿足以上要求,檢測結(jié)果無效。8.2檢出限8.2.1食品樣品:液態(tài)樣品及溶解后的粉狀樣品0.25ng/mL,其他樣品0.375ng/g(mL)。8.2.2金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液0.25ng/mL。8.3臨界值計算8.4結(jié)果判定及報告8.4.1葡萄球菌腸毒素檢測若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)<臨界值,報告未檢出葡萄球菌腸毒素。若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)≥臨界值,報告檢出葡萄球菌腸毒素。8.4.2葡萄球菌腸毒素分型檢測若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)<臨界值,報告未檢出某型葡萄球菌腸毒素。若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)≥臨界值,報告檢出某型葡萄球菌腸毒素。9質(zhì)量控制9.1實驗前應(yīng)確認試劑盒有效期,如陽性質(zhì)控孔的吸光度(OD)<1.0或底物/發(fā)色劑在使用前顏色變藍則表明試劑已失效,不得使用。9.2若檢測結(jié)果的吸光度(OD)超出儀器讀值的線性范圍,則需要用PBS緩沖液稀釋培養(yǎng)物上清液,重新檢測。9.3當葡萄球菌腸毒素分型檢測同時檢出兩種或兩種以上腸毒素時,按附錄C對檢測結(jié)果進行修正。9.4金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液前處理(除離心操作外)、葡萄球菌腸毒素定性及分型檢測等實驗操作應(yīng)在生物安全柜中進行。5T/CIFST017—20239.5在稱量、均質(zhì)樣品和葡萄球菌腸毒素檢測三個實驗階段分別佩戴新的一次性乳膠手套。10生物安全按照GB19489處理實驗廢棄物。6T/CIFST017—2023(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒A.1試劑盒組成葡萄球菌腸毒素檢測試劑盒RIDASCREENSETTotal包括:A.1.1預(yù)包被葡萄球菌腸毒素多價抗體的可拆分微孔板:8×12孔;A.1.2陽性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;A.1.3陰性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;A.1.410×洗滌緩沖液濃縮液:100mL/瓶×1瓶;A.1.5酶標記物1溶液:11mL/瓶×1瓶;A.1.6酶標記物2溶液:11mL/瓶×1瓶;A.1.7底物/發(fā)色劑:13mL/瓶×1瓶;A.1.8終止液:14mL/瓶×1瓶。A.2試劑盒保存及使用A.2.1試劑盒于2℃~8℃黑暗處避光保存,使用前回復(fù)至室溫(20℃~25℃);使用完盡快放回2℃~8℃,不可冷凍。未使用的微孔板孔,必須與袋中的干燥劑一起,重新放入鋁箔封口袋中并封好,2℃~8℃保存。A.2.2不同批號試劑盒中組分不得混用。A.2.3超過有效期的試劑盒不得使用。7T/CIFST017—2023附錄B(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素分型檢測試劑盒B.1試劑盒組成葡萄球菌腸毒素分型檢測試劑盒RIDASCREENSETA、B、C、D、E包括:B.1.1可拆分微孔板(8×12孔):A~E孔預(yù)包被葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E型特異性抗體,H孔預(yù)包被葡萄球菌腸毒素多價抗體,F和G孔預(yù)包被非葡萄球菌腸毒素的特異性抗體;B.1.2陽性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;B.1.310×洗滌緩沖液濃縮液:100mL/瓶×1瓶;B.1.4酶標記物1溶液:11mL/瓶×1瓶;B.1.5酶標記物2溶液:11mL/瓶×1瓶;B.1.6底物/發(fā)色劑:13mL/瓶×1瓶;B.1.7終止液:14mL/瓶×1瓶。B.2試劑盒保存及使用B.2.1試劑盒于2℃~8℃黑暗處避光保存,使用前回復(fù)至室溫(20℃~25℃);使用完盡快放回2℃~8℃,不可冷凍。未使用的微孔板孔,必須與袋中的干燥劑一起,重新放入鋁箔封口袋中并封好,2℃~8℃保存。B.2.2不同批號試劑盒中組分不得混用。B.2.3超過有效期的試劑盒不得使用。8T/CIFST017—2023附錄C(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素分型檢測結(jié)果修