生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化原理與技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

《生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化原理與技術(shù)》課堂實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐指導(dǎo)書課程中文名稱：生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化原理與技術(shù)課程英文名稱：BiomassEnergyTransformationPrinciple課程編號(hào)：021060380適用專業(yè)：新能源科學(xué)與工程學(xué)時(shí)數(shù)：總課時(shí)32（理論課28+實(shí)驗(yàn)4）學(xué)分?jǐn)?shù)：2課程類別：專業(yè)課程應(yīng)開課學(xué)期：第七學(xué)期實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐一：培養(yǎng)基的制備及厭氧菌群的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐類型：演示實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐學(xué)時(shí)：2實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐要求：必做一、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐目的掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗；掌握培養(yǎng)基的配置方法以及厭氧菌的培養(yǎng)方法；掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法；加深對(duì)理論知識(shí)的理解，培養(yǎng)動(dòng)手和動(dòng)腦相結(jié)合的實(shí)際操作能力。實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐內(nèi)容1.根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿；2.根據(jù)要求配制培養(yǎng)基，用高壓蒸汽滅菌鍋對(duì)所配各培養(yǎng)基滅菌；對(duì)礦井水中的厭氧菌群進(jìn)行培養(yǎng)。三、實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備1.培養(yǎng)基配方1）產(chǎn)甲烷菌富集基：每1000mL礦井水中加入1.0gNH4Cl、0.1gMgCl2·6H2O、0.4gK2HPO4·3H2O、0.2gKH2PO4、0.2gNa2S、2.0gNaHCO3、0.001gC12H7NO4、0.5gC3H7NO2S、2.0gHCOONa、2.0gCH3COONa、1.0g酵母膏、0.1g胰蛋白胨和10mL微量元素液。

2）微量元素液：每1000mL無(wú)菌去離子水中加入氨基三乙酸1.5g、MnSO4·2H2O0.5g、MgSO4·7H2O3.0g、FeSO4·7H2O0.1g、NaCl1.0g、CoCl2·6H2O0.1g、CaCl2·2H2O0.1g、CuSO4·5H2O0.01g、ZnSO4·7H2O0.1g、H3BO30.01g、AlK(SO4)20.01g、NiCl2·6H2O0.02g、Na2MoO40.01g。2.儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，往復(fù)式恒溫?fù)u床，pH計(jì)，血清瓶及配套設(shè)備，市售醫(yī)用一次性無(wú)菌注射器。四、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐原理、方法、手段和步驟一、實(shí)驗(yàn)原理：在培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要消除環(huán)境中的氧氣并降低培養(yǎng)基的氧化還原勢(shì)。消除氧氣的方法有物理、化學(xué)和生物方法，或它們的綜合使用。簡(jiǎn)單地介紹如下：(1).通無(wú)氧氣體。向厭氧微生物培養(yǎng)的小環(huán)境和培養(yǎng)基中通入無(wú)氧氣體，如高純氮?dú)夂投趸?，即可基本?qū)除其中的氧氣。(2).添加還原劑。向培養(yǎng)厭氧微生物的培養(yǎng)基中添加還原劑，如半胱氨酸和硫化鈉，可消除其中的氧，降低培養(yǎng)基的氧化還原勢(shì)。(3).堿性焦性沒(méi)食子酸法。焦性沒(méi)食子酸與堿溶液作用后形成易被氧化的堿性沒(méi)食子鹽，能通過(guò)氧化作用而形成黑、褐色的焦性沒(méi)食子橙，從而除掉密封容器中的氧。該法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊和昂貴的設(shè)備，但其除氧速度較慢。對(duì)于一些厭氧要求較高的微生物，如產(chǎn)甲烷菌，單一的除氧方法無(wú)法達(dá)到其生長(zhǎng)所需的厭氧程度，常需結(jié)合兩種除氧方法。如對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行除氧，制作預(yù)還原培養(yǎng)基時(shí)，常先向培養(yǎng)基中通高純氮?dú)猓热コ囵B(yǎng)基中的絕大部分的氧后，再往培養(yǎng)基中添加適量的還原劑，即可制成高度無(wú)氧的預(yù)還原培養(yǎng)基。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2.液體培養(yǎng)基的配制過(guò)程稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量．然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來(lái)水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。過(guò)濾：用濾紙或多層紗布過(guò)濾培養(yǎng)基。一般無(wú)特殊要求時(shí)，此步可省去。3.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無(wú)菌檢查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無(wú)菌后方可使用。4.無(wú)菌水的制備在每個(gè)250mL的三角瓶?jī)?nèi)裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內(nèi)裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌20~30min。5.厭氧菌培養(yǎng)將配制好的產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基，裝入到121℃滅菌后的錐形瓶中，充氮?dú)?min后迅速密封，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中，在35℃條件下厭氧發(fā)酵4d，得到產(chǎn)甲烷菌群的富集溶液。五、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐結(jié)果處理對(duì)比三角瓶中菌體的生長(zhǎng)以及產(chǎn)氣情況（條件允許可拍照）并予以分析。六、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐注意事項(xiàng)1．實(shí)驗(yàn)一般不允許學(xué)生請(qǐng)假，確因特殊情況需要請(qǐng)假，須事先經(jīng)指導(dǎo)教師和主管教學(xué)院長(zhǎng)批準(zhǔn)；2．實(shí)驗(yàn)期間，不得遲到、早退，有事必須向指導(dǎo)教師請(qǐng)假，不得擅自離隊(duì)。必須服從指揮、注意聽講、認(rèn)真參觀、多加思考、記好筆記；3．嚴(yán)格遵守組織紀(jì)律，禁止進(jìn)入受限空間，遵守紀(jì)律，注意安全，未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室老師的許可，不得亂動(dòng)任何設(shè)備。4．滅菌過(guò)程中，達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。七、預(yù)習(xí)與思考題簡(jiǎn)述配制培養(yǎng)基的基本步驟及注意事項(xiàng)。配制培養(yǎng)基時(shí)為什么要調(diào)節(jié)pH？高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時(shí)間短？厭氧培養(yǎng)的基本原理以及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐二：厭氧發(fā)酵液液相成分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐類型：演示實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐學(xué)時(shí)：2實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐要求：必做一、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐目的1．熟悉厭氧發(fā)酵過(guò)程中液相成分的組成及含量，認(rèn)識(shí)并使用測(cè)試儀器和主要器皿；2．掌握各種儀器性能及使用方法，熟悉各種液相成分測(cè)定的操作方法；3．加深對(duì)理論知識(shí)的理解，培養(yǎng)動(dòng)手和動(dòng)腦相結(jié)合的實(shí)際操作能力。二、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐內(nèi)容1．了解并認(rèn)識(shí)發(fā)酵液液相成分所需儀器設(shè)備，熟悉液相成分測(cè)試流程以及操作過(guò)程中的規(guī)章和規(guī)定；2．了解并認(rèn)識(shí)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的基本結(jié)構(gòu)、工作原理，熟悉儀器操作流程以及操作過(guò)程中的規(guī)章和規(guī)定；三、儀器設(shè)備揮發(fā)性脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、離心機(jī)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、萃取儀、容量瓶、內(nèi)標(biāo)液、乙酸乙酯四、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐原理、方法、手段和步驟一、實(shí)驗(yàn)原理：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是一種質(zhì)譜儀，氣相色譜的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當(dāng)多組分的混合樣品進(jìn)入色譜柱后，由于吸附劑對(duì)每個(gè)組分的吸附力不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來(lái)，最先離開色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，而吸附力最強(qiáng)的組分最不容易被解吸下來(lái)，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進(jìn)入檢測(cè)器中被檢測(cè)、記錄下來(lái)。質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1．標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制根據(jù)需要配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液體待用。以揮發(fā)性脂肪酸為例：準(zhǔn)確稱取各短鏈脂肪酸對(duì)照品，用無(wú)水乙醇溶解并定容，得到7種標(biāo)準(zhǔn)品的單儲(chǔ)備液，并加入50uLd4-乙酸內(nèi)標(biāo)溶液，根據(jù)需要配置系列工作溶液。2．樣品前處理取凍存的樣品，加1000μL乙酸乙酯溶液(含0.5%(V/V)濃HCl)，加入50uLd4-乙酸內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，超聲40min萃取，然后14000r/min離心10min，取上清液直接進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。3．儀器條件氣相色譜分析條件為毛細(xì)管柱采用DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱[30m（長(zhǎng)度）×0.25mm（內(nèi)徑）×0.25m（膜厚）]，載氣為氦氣，載氣流速為1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流。升溫程序：初始溫度50℃保持2min，以15℃/min升至120℃，以5℃/min升至170℃，以15℃/min升至240℃后保持3min。MS條件：電子轟擊電離（EI）源，全掃及SIM掃描方式，電子能量70eV。五、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐結(jié)果處理將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度比上內(nèi)標(biāo)濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品的峰面積比上內(nèi)標(biāo)峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中目標(biāo)物含量。六、實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐注意事項(xiàng)1．實(shí)驗(yàn)一般不允許學(xué)生請(qǐng)假，確因特殊情況需要請(qǐng)假，須事先經(jīng)指導(dǎo)教師和主管教學(xué)院長(zhǎng)批準(zhǔn)；2．實(shí)驗(yàn)期間，不得遲到、早退，有事必須向指導(dǎo)教師請(qǐng)假，不得擅自離隊(duì)。必須服從指揮、注意聽講、認(rèn)真參觀、多加思考、記好筆記；3．嚴(yán)格遵守組織紀(jì)律，禁止進(jìn)入受限空間，遵守紀(jì)律，注意安全，未