《梅毒實驗室診斷方法》

《梅毒實驗室診斷方法》梅毒實驗室診斷梅毒的實驗室診斷方法主要有顯微鏡檢查法和血清學(xué)檢測法。

一、顯微鏡檢查法（一）暗視野顯微鏡檢查梅毒硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損的滲出液涂片，以及淋巴結(jié)穿刺液涂片等，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。1．暗視野顯微鏡。

2．鈍刀（刮勺）、載玻片、蓋玻片、注射器具、無菌生理鹽水。1．皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液與預(yù)先滴加在載玻片上的生理鹽水混合后加蓋玻片鏡檢。

2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結(jié)，注入生理鹽水并反復(fù)抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。1．加鏡油：在暗視野顯微鏡的聚光器上滴加鏡油。

2．聚光：將標本玻片置載物臺上，上升聚光器使鏡油接觸載玻片底面。

3．鏡檢：在鏡下觀察，尋找有特征形態(tài)和運動方式的梅毒螺旋體。XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX、告XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX梅毒螺旋體在暗視野顯微鏡鏡下表現(xiàn)為纖細、白色、有折光的螺旋狀微生物，長5～20mm，直徑小于0.2mm，有6～12個螺旋，具有旋轉(zhuǎn)、蛇行及伸縮等三種特征性的運動方式。暗視野顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有上述特征的螺旋體為陽性結(jié)果。1．陽性：見到上述特征的梅毒螺旋體。

2．陰性：未見到上述特征的梅毒螺旋體。1．暗視野顯微鏡檢查陽性,可確診梅毒。

2．螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最好方法，世界衛(wèi)生組織指定為性病實驗室必備項目之一。

3．如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性，應(yīng)復(fù)查和血清學(xué)檢查。1.取材時盡量避免出血，以免影響鏡下觀察。

2.取材后應(yīng)立即置暗視野顯微鏡下觀察。

3.鏡下觀察時應(yīng)注意與其他螺旋體相鑒別。

（二）鍍銀染色檢查梅毒螺旋體具有親銀性，可被銀溶液染色，從而可以在鏡下觀察到梅毒螺旋體。1．顯微鏡。

2．羅吉氏固定液、鞣酸媒染劑、Fontana氏銀溶液。1.皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液涂片。

2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結(jié)，注入生理鹽水并反復(fù)抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上。1．涂片干燥：將標本涂于干凈載玻片作一薄片，于空氣中自然干燥。

2．固定：用固定液將涂片固定2～3分鐘。

3．洗滌：用無水乙醇洗滌玻片上的油污。

4．媒染：加媒染劑于涂片上，微加熱產(chǎn)生蒸汽，染30秒。

5．銀染：水洗，加銀染液于涂片上，微加熱產(chǎn)生蒸汽，染30秒。

6．鏡檢：水洗、待干，用油鏡檢查。顯微鏡下見到染成棕褐色的梅毒螺旋體為陽性結(jié)果。1．陽性：見到染成棕褐色梅毒螺旋體。

2．陰性：未見到染成棕褐色的梅毒螺旋體。同暗視野顯微鏡檢查法。應(yīng)注意與其他螺旋體加以鑒別。

二、血清學(xué)檢測法（一）非梅毒螺旋體抗原血清試驗非梅毒螺旋體抗原血清試驗，包括性病研究實驗室（VDRL）試驗、快速血漿反應(yīng)素（RPR）環(huán)狀卡片試驗、甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等。

nVDRL試驗梅毒螺旋體感染人體后，宿主會產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（反應(yīng)素），與一定比例的心磷脂、卵磷脂及膽固醇混合物抗原反應(yīng)，可檢測梅毒患者血中的抗類脂抗原的抗體。1.水平旋轉(zhuǎn)儀、顯微鏡。

2.試劑盒：VDRL抗原原液、VDRL緩沖液、抗原滴管及針頭、帶直徑14mm漆圈的玻璃反應(yīng)板、VDRL試驗結(jié)果參照圖片。

3.30mL平底玻璃小瓶、生理鹽水。1.血清：抽取靜脈血，室溫靜止凝固后，分離新鮮血清。也可采用凍存的血清。

2.腦脊液：采用腰椎穿刺術(shù)獲得，應(yīng)由相關(guān)專業(yè)人員操作。1.VDRL抗原配制。

2.VDRL玻片定性試驗（1）滅活：血清標本56℃滅活30分鐘。（2）吸樣：吸取0.05mL血清放入反應(yīng)板圈中，將血清涂布到整個圈內(nèi)。（3）加抗原：用標準針頭加入1滴抗原。（4）反應(yīng)：將反應(yīng)板置水平旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)4分鐘，〔(180±5)次/分鐘〕，立即置低倍顯微鏡下觀察。

3.VDRL定量試驗（1）加稀釋液：在圈內(nèi)加入0.05mL生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度）。（2）樣本稀釋：吸取0.05mL樣本與各圈中鹽水作系列稀釋并涂布整個圈內(nèi)。（3）以下步驟同定性試驗（2）～（4）。凝集反應(yīng)強度分級：

3＋～4＋：大的或中等大小的絮狀物，液體清亮2＋：絮狀物較小，液體較清亮1＋：絮狀物較小，均勻分布，液體混濁±：抗原復(fù)合物顆粒稍粗－：抗原顆粒均勻、細小1．定性試驗：

（1）陽性：鏡下可見1＋～4＋的絮狀凝集物。

（2）陰性：不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

2．定量試驗：

滴度：鏡下可見絮狀凝集物的血清最高稀釋倍數(shù)。對一期、二期、潛伏期和晚期梅毒患者的敏感性分別為78%、100%、96%和71%。腦脊液VDRL陽性對神經(jīng)梅毒有診斷意義。1．VDRL用抗原需當(dāng)天配制。

2．試驗反應(yīng)完畢，應(yīng)立即觀察結(jié)果。

nRPR試驗RPR試驗是VDRL試驗的一種改良方法。該法在心磷脂、卵磷脂和膽固醇等組成的抗原中加入活性炭顆粒，與待檢血清（漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的黑色絮狀物。1．水平旋轉(zhuǎn)儀。

2．RPR試劑盒：RPR抗原、直徑為18mm圓圈的反應(yīng)卡片、抗原滴管、針頭。1．血清：抽取靜脈血，室溫靜止凝固后，分離新鮮血清。也可采用凍存的血清。

2．血漿：各種抗凝劑制備的血漿。1．定性試驗（1）加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)。（2）加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原。（3）反應(yīng)：將卡片置水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘。立即在亮光下觀察結(jié)果。

2．定量試驗（1）稀釋液準備：在圈內(nèi)加入0.05mL生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。（2）加樣：吸取0.05mL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。（3）同定性試驗（2）～（4）。凝集反應(yīng)強度分級：

3＋～4＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的黑色絮狀物，液體清亮2＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到中的黑色絮狀物，液體較清亮1＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的黑色絮狀物，液體混濁－：圓圈內(nèi)僅見碳顆粒集于中央一點或均勻分散1．定性試驗：

（1）陽性：出現(xiàn)1＋～4＋強度的凝集反應(yīng)。

（2）陰性：不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

2．定量試驗：

滴度：出現(xiàn)凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)。1．RPR試驗適用于梅毒篩查、療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。

2．對未經(jīng)治療的一期、二期和潛伏梅毒患者的敏感性分別為86%、100%和98%。試驗應(yīng)在23～29℃環(huán)境中進行。

nTRUST試驗TRUST試驗是用甲苯胺紅顆粒代替RPR試驗中的碳顆粒作為指示物，所以陽性結(jié)果為紅色絮狀物。其基本原理、儀器材料、標本采集、操作步驟、結(jié)果判讀、結(jié)果報告、臨床意義及注意事項等與RPR試驗基本相同。

（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗梅毒螺旋體抗原血清試驗是以梅毒螺旋體為抗原的特異性的抗原抗體反應(yīng)，用以檢測梅毒抗體，常用的方法有梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）、梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA）和梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（TP-WB）等方法。nTPPA試驗TPPA試驗是用超聲裂解梅毒螺旋體制備的抗原，致敏明膠粒子，其致敏粒子與待檢血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集。1.微量震蕩器。

2.試劑盒：“A”溶解用液、“B”標本稀釋液、“C”致敏粒子、“D”未致敏粒子、“E”質(zhì)控血清。3．U型反應(yīng)板。同RPR試驗。1．試劑準備：試驗前將待檢樣本和試劑應(yīng)恢復(fù)到室溫。2．加稀釋液：每份樣本做4孔，加B液至反應(yīng)孔內(nèi)，第1孔100μL，第2～4孔各25μL。3．樣本稀釋：取血清25μL加至第1孔，混勻后取25μL至第2孔，連續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25μL。

4．加對照液：第3孔加D液25μL，第4孔加C液25μL。5．混合：將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30秒。6．反應(yīng)：置濕盒內(nèi)，孵育2小時后，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。觀察凝集反應(yīng)強度，分級如下：

4＋：

粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊3＋：

粒子光滑覆蓋大部分孔底2＋：

粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細胞環(huán)1＋：

粒子光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯細胞環(huán)±：

粒子沉集孔底，中央形成一小點－：

粒子緊密沉積孔底中央1．陽性：未致敏粒子不出現(xiàn)凝集（第3孔），血清1︰80以上稀釋與致敏粒子產(chǎn)生1＋～4＋凝集反應(yīng)。

2.陰性：未致敏粒子和致敏粒子均不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。1.TPPA可作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初篩陽性標本的確證試驗。

2．梅毒患者經(jīng)過抗梅治療后，TPPA試驗仍可陽性，故TPPA試驗陽性不能作為療效觀察的指標。

3．TPPA陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結(jié)果進行診斷。1.試驗結(jié)果為“可疑”時，應(yīng)選用其他的試驗方法進行復(fù)驗。2.如未致敏粒子出現(xiàn)凝集反應(yīng)，樣本進行吸收后再進行試驗，或改用其他試驗方法。

nTPHA試驗TPHA試驗用超聲裂解的梅毒螺旋體菌體為抗原，致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類紅細胞，與抗梅毒螺旋體抗體反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體凝集。1.微量震蕩器。

2．TPHA試劑盒：“A”溶解用液、“B”標本稀釋液、”C”致敏粒子、“D”未致敏粒子、“E”質(zhì)控血清。3.U型反應(yīng)板。同RPR試驗。1．試劑準備：試驗前試劑恢復(fù)到15～25℃。2．加稀釋液：加B液至反應(yīng)板，第1孔25mL，第2孔100mL，第3～5孔各加25mL。3．樣本稀釋：取血清25mL加至第1孔，混勻后取25mL至第2孔，混勻后取25mL至第3孔，混勻后棄去25mL，再從第2孔取25mL至第4孔，混勻后取25mL至第5孔，混勻后棄去25mL。4．加對照液：第3孔加D液（未致敏細胞）75μL，第4、5孔加C液（致敏細胞）各75mL。5．混合：將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30秒。6．反應(yīng)：置濕盒內(nèi)，15～25℃孵育4小時，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。同TPPA試驗。同TPPA試驗。同TPPA試驗。有些采用禽類紅細胞為載體的TPHA試驗，血清不用吸收，可直接進行試驗。

nFTA-ABS試驗以完整的梅毒螺旋體作為抗原，與經(jīng)吸收劑吸收的梅毒血清抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，再加入熒光素（FITC）標記的抗人免疫球蛋白，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下螺旋體顯出蘋果綠色熒光。1．熒光顯微鏡。

2．試劑盒：梅毒螺旋體抗原片、吸收劑、熒光素標記抗體、陽性對照血清、PBS緩沖液、固定劑。3.血清稀釋板。同VDRL試驗。1.血清滅活：將血清標本于56℃滅活30分鐘，備用。

2.血清稀釋：待檢血清用吸收劑1：5稀釋，陽性血清及陰性血清分別用PBS緩沖液和吸收劑1:5稀釋。置37℃濕盒內(nèi)，30分鐘。

3.加樣：每次試驗必須設(shè)PBS緩沖液、吸收劑、PBS液1︰5稀釋陽性和陰性血清及吸收劑1：5稀釋陽性和陰性血清共6個對照涂片。每個涂片分別加入10μL稀釋后的血清或緩沖液，置37℃濕盒內(nèi)，30分鐘。

4.洗滌：用PBS-Tween-80液洗玻片2次，每次5分鐘，最后用蒸餾水洗一次，冷風(fēng)干燥。

5.加熒光抗體：每個涂片加10μL按要求稀釋的熒光抗體,置37℃濕盒內(nèi)30分鐘。

6.洗滌：同步驟4。

7.封片鏡檢：用固定劑封片，讀片。1.陽性對照：無論PBS緩沖液還是吸附劑稀釋，熒光強度應(yīng)相同。

2.陰性對照和空白對照：不產(chǎn)生熒光。1.陽性：熒光鏡下見到不同程度發(fā)綠色熒光的螺旋體。

2.陰性：無熒光或密螺旋體微顯淡綠色。1.FTA-ABS是梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗的“金標準”。

2．對未經(jīng)治療的一期、二期、潛伏梅毒和晚期梅毒患者的敏感性分別為84%、100%、100%和96%，特異性均可達97%。3.其他同TPPA試驗。1.抗原片每次洗滌要干凈，避免其他雜質(zhì)影響判讀結(jié)果。

2.試驗需有高質(zhì)量熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員。

nTP-ELISA試驗TP-ELISA試驗是用包被在固相板條上經(jīng)超聲裂解、純化處理或重組的梅毒螺旋體抗原，與待檢血清中的梅毒特異性抗體結(jié)合，再與酶標記的抗人免疫球蛋白單克隆抗體反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物而使底物顯色。1.酶標儀、洗板機。

2．試劑盒組成：96孔反應(yīng)板、標本稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物、底物液、終止液、陽性對照、陰性對照。同RPR試驗1.加稀釋液：取標本稀釋液加到反應(yīng)板孔內(nèi)。2.孵育：分別加入陽性、陰性對照和待檢血清，置37℃孵育一定時間,洗板。

3.加酶結(jié)合物：加酶結(jié)合物，置37℃孵育一定時間,洗板。

4.加顯色劑：加底物，37℃避光孵育。

5.終止反應(yīng)：加終止液，酶標儀測OD（光密度）值。1．每次試驗的陽性、陰性對照應(yīng)在規(guī)定的數(shù)值范圍內(nèi)2．根據(jù)陽性、陰性O(shè)D值設(shè)定閾值（cut-off值）。1．陽性：標本OD值大于或等于cut-off值。

2．陰性：標本OD值小于cut-off值。（1）適用于流行病學(xué)調(diào)查或大樣本量標本的檢測。

（2）ELISA陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)結(jié)果進行診斷。1.不同批號試劑不能混用。2.溫度和時間必須嚴格控制?！鯰P-WB試驗用超聲粉碎的梅毒螺旋體或梅毒螺旋體重組的不同抗原，印跡至硝酸纖維膜條上。通過酶聯(lián)反應(yīng)，可檢測梅毒血清中多種特異抗原成分的抗體。1.水平搖床。

2.試劑盒:硝酸纖維膜條、酶標抗體、陽性質(zhì)控血清、陰性質(zhì)控血清、底物液、終止液、標準陽性反應(yīng)帶結(jié)果參比圖譜。同RPR試驗1．反應(yīng)：每反應(yīng)槽加2.0mL工作緩沖液，浸濕膜條5分鐘，加入0.02mL待檢樣本，置水平搖床上(50轉(zhuǎn)/分)，18～25℃反應(yīng)45分鐘。2．洗滌：棄去反應(yīng)槽中液體，加入2.0mL工作緩沖液，置水平搖床洗滌3次，每次5分鐘。3．加酶結(jié)合物：

加入酶標抗體，置水平搖床反應(yīng)30分鐘。4．洗滌：同步驟2。

5．顯色：每槽加2.0mL底物，置水平搖床上反應(yīng)8～10分鐘。

6．終止:待陽性對照帶顯色清晰，加入1.0mL終止劑2分鐘后棄去槽中液體，用蒸餾水洗2次，用鑷子取出反應(yīng)條，置濾紙上。1．根據(jù)陽性結(jié)果參比圖譜判定結(jié)果。2.將試驗的硝酸纖維膜條上端標記線與參比標記線對齊。

3．觀察45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)顯色帶。1．陽性：

45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)均出現(xiàn)顯色帶。

2．陰性：

45KD、17KD及15.5KD三個條帶均未顯色。1．同TPPA試驗2．可以用于檢測IgM或IgG抗體。1．洗滌要充分，否則易造成試驗?zāi)l帶背景的顏色偏深。

2．硝酸纖維膜條有對照反應(yīng)條帶，在試驗中應(yīng)顯示，如未顯示，則試驗無效。

3．當(dāng)45KD、17KD及15.5KD中只有一個或兩個條帶出現(xiàn)明顯色帶為可疑結(jié)果，需重新試驗。

n快速免疫層析法利用免疫層析原理，采用吸附有顯色標記的梅毒螺旋體重組抗原的濾紙條，快速檢測標本中的梅毒螺旋體抗體。試劑盒：測試板、一次性滴管。同RPR試驗，可用全血。1．加樣：用一次性滴管滴加一定量標本于加樣孔中。

2．加緩沖液：立即加入一定量的緩沖液。

3．觀察結(jié)果：規(guī)定時間內(nèi)判讀結(jié)果。1.觀察質(zhì)控條帶,判斷試驗有效性，如沒有出現(xiàn)質(zhì)控條帶，說明試驗無效，需重復(fù)試驗。

2．觀察標本條帶。1．陽性:出現(xiàn)標本條帶和質(zhì)控條帶。

2．陰性：無標本條帶，出現(xiàn)質(zhì)控條帶。1．可以用于標本的快速篩查。

2．快速檢測陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)結(jié)果進行診斷。1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時，應(yīng)平衡至室溫后方可使用。

2．本試驗方法存在一定的假陽性和假陰性。三、其它方法（一）梅毒IgM抗體的檢測與其它細菌及病毒感染一樣，在梅毒中特異性IgM抗體的合成是第一次感染后的體液免疫應(yīng)答。在梅毒中螺旋體IgM抗體出現(xiàn)在早期梅毒患者中，在潛伏期及晚期患者也能發(fā)現(xiàn)。