TGXAS-蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè) 熒光定量PCR法編制說(shuō)明

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)熒光定量PCR法》（征求意見(jiàn)稿）編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源和起草單位根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)關(guān)于下達(dá)2021年第三十八批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2021〕99號(hào)）文件精神，由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院提出申報(bào)的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)熒光定量PCR法》（項(xiàng)目編號(hào)2021-3802）已獲立項(xiàng)。該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院提出、由廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站和廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院共同起草。二、標(biāo)準(zhǔn)制定的目的和意義蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)屬于腸胞蟲(chóng)科、腸胞蟲(chóng)屬的一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲(chóng)，在2004年最早發(fā)現(xiàn)于泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦并于2009年首次被分離和正式命名報(bào)道，主要感染凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦等重要養(yǎng)殖蝦類(lèi)，是近10年危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病原之一。EHP感染主要導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，表現(xiàn)為對(duì)蝦消瘦、大小不均、重量離散；還可導(dǎo)致患病蝦肝胰腺遭到破壞，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡。目前，EHP已對(duì)全球?qū)ξr產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，印度、委內(nèi)瑞拉、中國(guó)、泰國(guó)、越南、馬來(lái)西亞以及文萊等國(guó)家均有該病原檢出并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的報(bào)道。鑒于EHP引起的蝦肝腸胞蟲(chóng)?。‥HPD）的嚴(yán)重危害性，我國(guó)從2017年起已將EHPD納入《國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃》，且規(guī)定陽(yáng)性場(chǎng)處置參照一類(lèi)疫病處置措施實(shí)施；近幾年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，我國(guó)沿海多省市的監(jiān)測(cè)樣品檢出EHP陽(yáng)性，檢出品種包括凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、克氏原螯蝦和青蝦等我國(guó)主要養(yǎng)殖蝦品種，表明EHP已成為我國(guó)蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要威脅。EHP的危害與其感染數(shù)量密切相關(guān)，輕度感染基本上不影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育，中度感染影響對(duì)蝦的營(yíng)養(yǎng)吸收，嚴(yán)重感染損壞對(duì)蝦免疫系統(tǒng)。因此，非常必要建立一種快速且準(zhǔn)確的EHP定量檢測(cè)方法用于蝦苗檢疫、親蝦篩選、以及成蝦養(yǎng)殖疫情監(jiān)測(cè)過(guò)程中根據(jù)其定量數(shù)據(jù)及對(duì)蝦養(yǎng)殖模式制定相應(yīng)措施。迄今為止國(guó)際(OIE)和國(guó)內(nèi)均沒(méi)有TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。熒光定量PCR(Real-timePCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，通過(guò)儀器檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知核酸模板進(jìn)行定量分析的方法，具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、能定量檢測(cè)病原體感染的強(qiáng)弱等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原體最理想的方法；而TaqMan-MGB探針則是熒光定量PCR使用的一種熒光探針，其3′端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的MGB(MinorGrooveBinder)結(jié)合物，可實(shí)現(xiàn)高Tm值的探針長(zhǎng)度縮短易于與模板退火而利于提高方法的靈敏度，且探針3′端不發(fā)光的淬滅基團(tuán)與5′端報(bào)告基團(tuán)在空間的位置更接近，使熒光本底降低、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分辨率更高，因此TaqMan-MGB探針憑借其技術(shù)優(yōu)勢(shì)已廣泛應(yīng)用于人及動(dòng)植物各種病原體的定量檢測(cè)。目前，檢測(cè)EHP國(guó)內(nèi)使用的方法為套氏PCR，相比較熒光定量PCR，其操作更繁瑣，需要電泳步驟，增大交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。就EHP的監(jiān)測(cè)工作，建立敏感性高、特異性強(qiáng)、操作更簡(jiǎn)便的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法并制定標(biāo)準(zhǔn)用于病原檢測(cè)，對(duì)有效防控由EHP引起的蝦病害具有重要意義。三、標(biāo)準(zhǔn)的編制過(guò)程1、成立編制工作組。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)熒光定量PCR法》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院會(huì)同廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣站成立了此標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制訂了編制總體工作方案及進(jìn)度安排，確定了標(biāo)準(zhǔn)中主要內(nèi)容草案，明確了任務(wù)分工及工作技術(shù)路線。2、資料收集、方法建立。確定編制工作小組后即展開(kāi)調(diào)查研究，收集資料，包括國(guó)內(nèi)、區(qū)內(nèi)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)內(nèi)公開(kāi)發(fā)表的相關(guān)技術(shù)性資料。查閱是否有相關(guān)的熒光定量PCR方法應(yīng)用于蝦肝腸胞蟲(chóng)1的檢測(cè)，經(jīng)綜合分析研判，編制人員根據(jù)分工，采購(gòu)試劑、設(shè)計(jì)引物探針、結(jié)合項(xiàng)目組開(kāi)展的相關(guān)科研和檢測(cè)工作基礎(chǔ)，收集已保存的蝦蝦肝腸胞蟲(chóng)病原，開(kāi)展反復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品制備、敏感性、特異性、穩(wěn)定性測(cè)試，初步建立蝦肝腸胞蟲(chóng)TaqMan-MGB探針熒光定量PCR方法。3、優(yōu)化方法，形成征求意見(jiàn)稿。標(biāo)準(zhǔn)起草組成員在前期研究工作以及初步建立的方法上，將試劑濃度、各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化、改進(jìn)，篩選最佳反應(yīng)程序，建立標(biāo)準(zhǔn)的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR方法，制定熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的操作規(guī)程，標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)法律、法規(guī)要求，參考國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)資料以及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)資料進(jìn)行編寫(xiě)起草標(biāo)準(zhǔn)文稿。經(jīng)兩家起草單位工作人員討論修改，完成《蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)熒光定量PCR法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的征求意見(jiàn)稿。四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則1、實(shí)用性原則本文件是在充分查閱和收集相關(guān)資料文獻(xiàn)，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)尚未有TaqMan-MGB熒光定量PCR法檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)的情況下制定的，TaqMan-MGB熒光定量PCR方法在病原檢測(cè)中應(yīng)用廣泛成熟。本標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)研究，對(duì)于樣品的檢測(cè)，特異性、敏感性、操作簡(jiǎn)便性?xún)?yōu)于普通的PCR方法，廣西是對(duì)蝦養(yǎng)殖大區(qū)，近幾年來(lái)受蝦肝腸胞蟲(chóng)感染致病導(dǎo)致的損失巨大，因此，制定蝦肝腸胞蟲(chóng)的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)非常必要和實(shí)用，是廣西蝦養(yǎng)殖業(yè)疫病防控和可持續(xù)發(fā)展的需要。2、協(xié)調(diào)性原則本文件在編寫(xiě)過(guò)程中注意了與蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)問(wèn)題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫(xiě)本文件的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件在兼顧TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)的同時(shí)，還考慮到了檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)和需要，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個(gè)別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為該病原檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及依據(jù)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《蝦肝腸胞蟲(chóng)檢測(cè)熒光定量PCR法》主要章節(jié)內(nèi)容包括：試劑與材料、儀器設(shè)備、操作方法及結(jié)果判定；主要依據(jù)來(lái)源為長(zhǎng)期從事的病原分子生物學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)及參照的相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。1.試劑與材料試劑和材料是本標(biāo)準(zhǔn)中試驗(yàn)必備品，根據(jù)所使用的試劑和材料詳細(xì)列出使用到的試劑、主要儀器設(shè)備和耗材。1.1一般要求所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純?cè)噭辉囼?yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-2008一級(jí)水的要求。此條款針對(duì)試劑純度級(jí)別、試驗(yàn)用水達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中一級(jí)水要求。1.2引物與TaqMan-MGB探針上游引物EHP-qF、下游引物EHP-qR、TaqMan-MGB探針EHP-qP根據(jù)寡核苷酸序列人工合成，擴(kuò)增66bp的目的片段。使用濃度均為10μmol/L。使用前按本標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌DEPC水稀釋?zhuān)♂尯蠓盅b成小量置于-20℃引物序列是PCR檢測(cè)的核心，其使用濃度決定擴(kuò)增效率，此條款給出引物序列及使用配制濃度、保存方法。1.3DNA抽提試劑及熒光定量PCR試劑商品化DNA抽提試劑盒、異丙醇等多種DNA提取的相關(guān)試劑；熒光定量PCR所用到的2×PremixExTaq?(ProbeqPCR)、ROXReferenceDye矯正液等。此條款在于說(shuō)明DNA提取及熒光定量PCR所用到的關(guān)鍵試劑，能達(dá)到同等效果的試劑或試劑盒均可選擇，依據(jù)的是試劑或試劑盒說(shuō)明書(shū)、多次試驗(yàn)結(jié)果。1.4儀器設(shè)備定量PCR儀、組織勻漿機(jī)、冰箱、高壓滅菌鍋、離心機(jī)等儀器設(shè)備。此條款列出所必備的儀器設(shè)備，可用不同品牌，但須滿(mǎn)足試驗(yàn)需要。1.5耗材微量移液器槍頭、離心管、0.2mLPCR管、塑料或乳膠手套等。此條款列出所必備的耗材，均為一次性使用，避免交叉污染，接觸到樣品的容器或移液槍頭高壓滅菌后使用，可用不同品牌耗材，但須滿(mǎn)足試驗(yàn)需要。2.操作方法具體規(guī)定了采樣、樣品前處理、對(duì)照樣品的處理、DNA提取、熒光定量PCR加樣體系。2.1采樣樣品采集按SC/T7103-2008（水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范）的規(guī)定執(zhí)行。采樣數(shù)量和方法與檢測(cè)結(jié)果得可靠性相關(guān)，此條款確定采樣按照國(guó)標(biāo)規(guī)定，減少漏檢和假陰性可能。2.2樣品前處理蝦樣按不同規(guī)格取不同組織。其中，受精卵、幼體、仔蝦采集整條蝦作為樣品，3cm以下幼蝦采集除蝦眼外整條蝦作為樣品，3cm以上蝦采集鰓、肝胰腺作為樣品。采集的樣品用組織勻漿機(jī)勻漿，立即進(jìn)行DNA提取操作或–80℃超低溫冰箱保存。此條款考慮到樣品的處理方式影響最終檢測(cè)結(jié)果，比如蝦眼含有PCR抑制物，需去除；成蝦的鰓和肝胰腺組織中病毒含量最高，選擇含毒量高的組織檢測(cè)，降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)，該條款根據(jù)其他標(biāo)準(zhǔn)中蝦樣品處理方法及文獻(xiàn)報(bào)道確定。2.3對(duì)照樣品的處理陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的采集和取樣參照檢測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行，將采集的蝦組織樣品勻漿后小量（30mg）分裝于1.5mL離心管后置于–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。每次檢測(cè)前各取出1管陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照樣品，與待檢樣品進(jìn)行后續(xù)操作。此條款規(guī)定必須設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)，以評(píng)價(jià)試驗(yàn)有效性。2.4DNA的提取取30mg樣品，按照商品化動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總DNA，最后加60μL洗脫緩沖液溶解DNA，置于–20℃保存?zhèn)溆?。此條款確定取樣量及DNA抽提方法，推薦采用試劑盒提取DNA，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，試劑盒提取DNA操作更簡(jiǎn)便、DNA損失少、純度更高。2.5TaqMan–MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立（此章節(jié)為補(bǔ)充方法種各指標(biāo)的支撐數(shù)據(jù)、圖和表）2.5.1引物與TaqMan-MGB探針的設(shè)計(jì)與合成采用PrimerExpress3.0軟件按熒光定量PCR引物和MGB探針的設(shè)計(jì)原則，在SSUrDNA基因(KF362129)保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物和TaqMan-MGB探針，其中探針的5′端標(biāo)記熒光染料FAM、3′端標(biāo)記MGB基團(tuán)。根據(jù)編碼核糖體小亞基的基因序列區(qū)（SSUrDNA）包含保守區(qū)和高變區(qū)，其中保守區(qū)序列進(jìn)化緩慢且相對(duì)保守，常被用作寄生蟲(chóng)檢測(cè)的靶基因；有研究也表明，EHP的SSUrDNA比SWP（孢子壁蛋白）基因更適合在對(duì)靈敏度要求更高時(shí)作為檢測(cè)EHP的靶基因。該條款，參考葉鍵等發(fā)表的研究論文《3種蝦肝腸胞蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用比較分析》。2.5.2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以EHPDNA為模板，滅菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。參考試劑及儀器使用說(shuō)明，在20μL反應(yīng)體系中加入2×ProbeqPCRPremixExTaq?10μL，ROXReferenceDyeⅡ0.2μL，上下游引物EHP-qF66/qR66(10μmol/L)0.4μL，探針EHP-qP66(10μmol/L)為0.4μL，模板DNA2μL，用滅菌水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火并延伸35s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在60℃結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5α，制備重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP，并進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。提取重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，并以10倍梯度稀釋至1.0×100～1.0×109拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品，–20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訣HPDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期目的片段大小一致的特異性條帶(圖1)；重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定，所得目的片段序列與GenBank上公布的EHP-SSUrDNA基因在本研究上下游引物之間序列的同源性為100%，說(shuō)明目的基因片段正確連接入pMD18-T載體，即重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP構(gòu)建成功(圖1)。圖1EHP-SSUrDNA基因的PCR擴(kuò)增及pMD18-T-SSUEHP的PCR鑒定結(jié)果M:DL500DNAMarker;1-3:EHP-SSUrDNA基因;4-6:pMD18-T-SSUEHP;NC:陰性對(duì)照2.5.3熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化以3個(gè)梯度(1.0×109、1.0×106、1.0×103拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，反應(yīng)體系中其他成分濃度不變，將上下游引物濃度以0.1μmol/L遞增設(shè)置為0.1～0.8μmol/L，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)閾值(Cyclethresholdvalue，Ct值)和擴(kuò)增曲線的熒光信號(hào)強(qiáng)度(ΔRn)選擇最優(yōu)引物濃度。結(jié)果顯示，隨著引物濃度增大，ΔRn增大、Ct值減小，但引物終濃度在0.6～0.8μmol/L時(shí)的效果（Ct值和ΔRn）相差不大（其中以1.0×106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板的結(jié)果見(jiàn)圖2A）。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為保證引物的擴(kuò)增效率又不浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料，本研究最終確定0.6μmol/L為最佳引物終濃度。圖2A熒光定量PCR的引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)圖2B熒光定量PCR的探針濃度優(yōu)化試驗(yàn)分別以1.0×109、1.0×106、1.0×103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，探針濃度為0.1～0.8μmol/L時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的結(jié)果顯示，隨著探針濃度增大，ΔRn增大、Ct值減小，但探針終濃度在0.5～0.8μmol/L時(shí)的效果（Ct值和ΔRn）相差不大（其中以1.0×106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板的結(jié)果見(jiàn)圖2B）。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為保證探針的效率又不浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料，選定0.6μmol/L為最佳探針濃度。通過(guò)引物濃度和探針濃度優(yōu)化后，確定熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系為：2×ProbeqPCRPremixExTaq?(2×)10μL，ROXReferenceDyeⅡ0.2μL，上下游引物EHP-qF66/qR66(10μmol/L)1.2μL，探針EHP-qP66(10μmol/L)1.2μL，模板2μL，用滅菌水補(bǔ)足至20μL。2.5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn)以10個(gè)梯度(1.0×109～1.0×100拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，采用優(yōu)化后熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)；利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，建立起始模板拷貝數(shù)(X)的對(duì)數(shù)與Ct值(Y)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴(kuò)增結(jié)果來(lái)判斷該方法的定量范圍和敏感性。結(jié)果顯示(圖3A)，各梯度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線重復(fù)性好、熒光強(qiáng)度增量明顯，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109～1.0×103拷貝/μL)的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×102～1.0×100拷貝/μL)的擴(kuò)增曲線因未達(dá)擴(kuò)增平臺(tái)期呈半“S”型，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)任何擴(kuò)增。經(jīng)數(shù)據(jù)分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3B)，起始模板拷貝數(shù)為2.0×109～2.0×100拷貝/μL時(shí)，模板濃度的對(duì)數(shù)與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.232*LOG(X)+39.51，Eff.(擴(kuò)增效率)和RSq(相關(guān)系數(shù)方值)分別為103.9%和1.000；標(biāo)準(zhǔn)品DNA為20拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct值分別為34.81、34.88、34.91，仍有明顯的擴(kuò)增曲線(圖3A)，且重復(fù)性好；標(biāo)準(zhǔn)品DNA為2拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct值分別為37.84、38.28、38.71，重復(fù)性差。因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議在實(shí)際檢測(cè)工作中以Ct值35為界限，若檢測(cè)樣品的Ct值小于或等于35，且有擴(kuò)增曲線，則判為EHP陽(yáng)性；Ct值大于35，且有擴(kuò)增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為EHP陽(yáng)性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為EHP陰性。上述結(jié)果表明，本研究建立的EHP熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品具有很高的擴(kuò)增效率，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板為2.0×109～2.0×101拷貝/反應(yīng)時(shí)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，可用于EHP的定量分析，靈敏度約為20個(gè)拷貝/反應(yīng)。圖3A標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109~1.0×100拷貝/μL)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖3B熒光定量PCR檢測(cè)EHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.5.5特異性試驗(yàn)分別以EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、V.harveyi、V.vnlnificus的核酸DNA為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法的特異性。結(jié)果為圖4，只有EHP出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值分別為22.07、22.10、22.16，判為陽(yáng)性；而其他病原及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為陰性。說(shuō)明本研究建立的熒光定量PCR對(duì)EHP的檢測(cè)具有很強(qiáng)的特異性。圖4熒光定量PCR的特異性檢測(cè)2.5.6重復(fù)性試驗(yàn)選取3個(gè)梯度(1.0×107、1.0×105、1.0×103拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，在間隔第7天和第14天分別進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，記錄各次試驗(yàn)的Ct值，分析組內(nèi)及組間的Ct值變異系數(shù)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及方法的重現(xiàn)性。變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)。3組標(biāo)準(zhǔn)品在間隔第7天和第14天分別進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2，組內(nèi)的實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)為0.26%～0.72%，組間實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)為0.56%～0.92%，表明本研究建立的熒光定量PCR方法重現(xiàn)性好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠；同時(shí)說(shuō)明本研究制備的重組質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照使用。表2EHP熒光定量PCR重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)組內(nèi)試驗(yàn)組間試驗(yàn)第1天第7天第14天Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)Ct±SDCV(﹪)1×10715.69±0.070.4515.83±0.090.5915.98±0.120.7215.83±0.150.921×10522.22±0.060.2722.38±0.090.3822.52±0.120.5122.37±0.150.671×10328.67±0.080.2628.75±0.110.3728.98±0.140.4828.80±0.160.563.結(jié)果判定3.1定性檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和空白對(duì)照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)有效；若檢測(cè)樣品的Ct值小于或等于35，且有擴(kuò)增曲線，則判為EHPDNA陽(yáng)性；Ct值大于35，且有擴(kuò)增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為EHPDNA陽(yáng)性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為EHPDNA陰性。此條款針對(duì)于只判定陽(yáng)性或陰性結(jié)果的樣品，無(wú)須對(duì)樣品病原含量進(jìn)行定量。3.2定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)小于或等于-0.970，陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和空白對(duì)照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)有效；檢測(cè)樣本中1×103拷貝/mg≤EHPDNA≤1×108拷貝/mg，測(cè)定結(jié)果有效，可直接報(bào)告陽(yáng)性及相應(yīng)的拷貝量；檢測(cè)樣本中EHPDNA＞1×108拷貝/mg，即可直接報(bào)告為＞1×108拷貝/mg，也可用滅菌DEPC水10倍梯度做相應(yīng)稀釋?zhuān)蛊淇截惲柯湓?×105～1×107拷貝/mg范圍內(nèi)再重新測(cè)定，測(cè)定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正；檢測(cè)樣本EHPDNA的拷貝量為1×101～1×103拷貝/mg時(shí)，建議對(duì)該樣本進(jìn)行雙份重試，如雙份樣本重試結(jié)果仍在1×101～1×103拷貝/mg，則按實(shí)際值計(jì)算；如雙份或一份重試結(jié)果＜1×101拷貝/mg，則判為陰性；Ct值不顯示時(shí)或EHPDNA的拷貝量＜1×101拷貝/mg，該樣本判為EHPDNA陰性。此條款將樣品中可能檢出的病原含量列出，以做出準(zhǔn)確判定，依據(jù)多次試驗(yàn)結(jié)果所作規(guī)定，前期進(jìn)行了重復(fù)性、穩(wěn)定性、敏感性等試驗(yàn)，方法穩(wěn)定、可靠、敏感性高，相對(duì)普通PCR操作更簡(jiǎn)便，交叉污染風(fēng)險(xiǎn)更小。結(jié)果判定中注明EHPDNA為陽(yáng)性或陰性，EHPDNA陽(yáng)性存在兩種情況，一是EHP感染中；一是曾受EHP感染，體內(nèi)含有檢測(cè)片段的DNA，但不一定還存在活的EHP，因此，此處結(jié)