核酸的理化性質(zhì)

核酸的理化性質(zhì)DNA與RNA得差異

DNA

RNA固體白色纖維狀大多為線形分子細(xì)長(zhǎng)溶液粘度大與酸和二苯胺共熱產(chǎn)生藍(lán)紫色白色粉末狀分子量較DNA小得多溶液粘度小能在室溫條件下被稀堿水解成核苷酸與濃鹽酸和苔黑酚共熱產(chǎn)生綠色核酸得物理化學(xué)性質(zhì)核酸得糖苷鍵和磷酸二酯鍵可被酸、堿或各自相應(yīng)得核酸酶水解成為各種成分,其水解程度因水解條件而異核酸和核苷酸既有磷酸基團(tuán),又有堿性基團(tuán),都就是兩性電解質(zhì)——酸堿性質(zhì)DNA和RNA都微溶于水,不溶于有機(jī)溶劑,提取分離核酸時(shí),可用乙醇將核酸從溶液中常沉淀出來核酸得紫外吸收特性因其所含堿基而引起核酸得變性與復(fù)性與其雙螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。一、核酸得水解二、核酸得酸堿性質(zhì)三、核酸得紫外吸收性質(zhì)四、核酸得變性、復(fù)性及雜交核酸得物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸得水解(一)酸水解糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解嘌呤堿基得糖苷鍵比嘧啶堿基得糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定(二)堿水解RNA得磷酸酯鍵易被堿水解,產(chǎn)生核苷酸。由于RNA得核糖上有2’-OH基,在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定,隨即水解產(chǎn)生,產(chǎn)生2’,3’-環(huán)磷酸酯,再水解成2’-核苷酸及3’-核苷酸相對(duì)而言DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定。(三)酶水解非特異性——磷酸二酯酶5′

p

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pOHB

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p3′BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶(5′端外切5得3)蛇毒磷酸二酯酶(3′端外切3得5)5′3′結(jié)構(gòu)式5'-核苷酸3'-核苷酸核酸酶得分類(1)底物

RNaseDNase(2)按作用方式核酸內(nèi)切酶核酸外切酶(5’→3’外切酶、3’→5’外切酶)(3)按斷裂磷酸二酯鍵得方式(4)其她:雙鏈酶、單鏈酶專一性水解磷酸二酯鍵——核酸酶有些核酸酶得特異性很高,能識(shí)別和切割DNA得特異序列,就是重要得工具酶限制性內(nèi)切酶

原核生物(及病毒)中存在著一類能識(shí)別外源DNA雙螺旋中4-8個(gè)堿基對(duì)所組成得特異得具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性得回文序列,并在此序列得某位點(diǎn)水解DNA雙螺旋鏈,產(chǎn)生粘性末端或平末端,這類酶稱為限制性內(nèi)切酶(ristrictionendonuclease)。山東落花生花落東山簾卷晚晴天,天晴晚卷簾WasitacatIsaw?常用得DNA限制性內(nèi)切酶得專一性酶辨認(rèn)得序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸,平端切口六核苷酸,平端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口六核苷酸,粘端切口限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌有何益處呢？30多年前,當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體得宿主特異性得限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí),首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶、細(xì)菌可以抵御新病毒得入侵,而這種"限制"病毒生存得辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA得限制性內(nèi)切酶、作為微生物免疫機(jī)制得一部分行使其功能、當(dāng)一個(gè)沒有限制性內(nèi)切酶得細(xì)菌被病毒感染時(shí),大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染、一個(gè)有限制性內(nèi)切酶得同種細(xì)菌被成功感染得比率顯著下降、出現(xiàn)更多得限制性內(nèi)切酶將會(huì)起到多重保護(hù)作用;而一個(gè)擁有4到5種各自獨(dú)立得限制性內(nèi)切酶將會(huì)使細(xì)胞堅(jiān)不可摧、

大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶(甲基化酶)出現(xiàn)、后者得作用就是保護(hù)細(xì)胞自身得DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞、修飾酶識(shí)別得位點(diǎn)與相應(yīng)得限制性內(nèi)切酶相同限制性內(nèi)切酶和她得“搭檔”--甲基化酶一起就構(gòu)成了限制-修飾(R-M)系統(tǒng)、在一些R-M系統(tǒng)中,限制性內(nèi)切酶和修飾酶就是兩種不同得蛋白,她們各自獨(dú)立行使自己得功能;而在另一些系統(tǒng)中,兩種功能由同一種限制-修飾酶得不同亞基,或就是同一亞基得不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行、

二、核酸得酸堿性質(zhì)1、堿基得解離2、核苷得解離3、核苷酸得解離結(jié)合及釋放質(zhì)子得能力堿基:含氮堿基,雜環(huán)化合物(很多生物堿得結(jié)構(gòu))1)、具有芳香環(huán)得結(jié)構(gòu)特征,呈平面或近乎平面含有共軛雙鍵體系,紫外區(qū)有吸收(260nm)。2)、氮原子位于環(huán)上或取代氨基上弱堿性來自于環(huán)上氮原子,pKa約9、5,傾向于接受H取代氨基(或曰堿基環(huán)外得氨基)堿性很弱,生理?xiàng)l件下不能被質(zhì)子化。1、堿基得解離1、堿基得解離胞嘧啶DNA嘧啶堿基得解離尿嘧啶胸腺嘧啶DNA嘌呤堿基得解離腺嘌呤鳥嘌呤得解離2、核苷得解離糖存在影響了堿基得解離——增強(qiáng)了堿基得酸性解離核糖中羥基也可以發(fā)生解離3、核苷酸得解離表14-1(重在看懂、理解)HHH某一基團(tuán)解離得離子化程度腺苷酸得等電點(diǎn)為？2、3鳥苷酸得等電點(diǎn)為1、55胞苷酸得等電點(diǎn)為2、65堿性極弱,尿苷酸基本可看做酸性核苷酸,不能算作兼性離子多核苷酸中磷酸二酯鍵中得磷酸基團(tuán)只有一個(gè)解離常數(shù)4、核酸得滴定曲線圖14-2小牛胸腺DNA得滴定曲線反映出變性DNA得滴定曲線改變

堿基得暴露II從pH12或pH2、5分別反向滴定I從pH6、9用酸或堿正向滴定

I天然II變性電極電位得變化,指示離子濃度得變化由于核酸分子中得磷酸就是一個(gè)中等強(qiáng)度得酸,而堿性(氨基)就是一個(gè)弱堿,所以核酸得等電點(diǎn)比較低。如DNA得等電點(diǎn)為4～4、5,RNA得等電點(diǎn)為2～2、5。RNA得等電點(diǎn)比DNA低得原因,就是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子得解離。三、核酸得紫外吸收性質(zhì)兩類核酸得紫外吸收譜均為260~290nm其最高吸收峰接近260nmDNA得紫外吸收譜光吸收（A）波長(zhǎng)/nm1就是天然DNA;2就是變性DNA;3就是核苷酸總吸收值小量DNA或RNA得紫外吸收法定量測(cè)定1、

對(duì)待測(cè)樣品就是否純得判斷可用紫外分光光度計(jì)讀出260nm和280nm得A值,計(jì)算A260/A280,從此值大小判斷樣品得純度,純得DNA得A260/A280應(yīng)為1、8;純得RNA應(yīng)為2、0。2、

對(duì)純核酸樣品得定量測(cè)定只要測(cè)出260nm得A值,即可計(jì)算含量。通常以1個(gè)A單位相當(dāng)于50ug/ml雙螺旋DNA;或40ug/ml得單鏈DNA(或RNA);或20ug/ml得寡核苷酸(或單核苷酸)。四、核酸得變性、復(fù)性與雜交(一)核酸得變性(denaturation)1、DNA得變性:

在某些理化因素作用下,DNA雙鏈解開成兩條單鏈得過程。

某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力,使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。不涉及磷酸二酯鍵斷裂,一級(jí)結(jié)構(gòu)不變2、變性得實(shí)質(zhì)降解:核苷酸骨架上3’,5’-磷酸二酯鍵得斷裂DNA變性得本質(zhì)就是雙鏈間氫鍵得斷裂DNA變性

高溫(一般＞75℃)—熱變性強(qiáng)酸、堿—酸堿變性甲醛(Agarose中RNA)尿素(PAGE中DNA)3、變性因素原理:與蛋白質(zhì)變性相似,破壞空間結(jié)構(gòu)中得次級(jí)鍵

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化完全變性后核酸紫外吸收值增加:天然DNA25－40%、RNA約1、1%實(shí)質(zhì):堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加得現(xiàn)象稱增色效應(yīng)提供了一個(gè)很好得檢測(cè)變性得方法！

變性RNA酶得分?jǐn)?shù)就是根據(jù)溶液得特性粘度增加、在365nm得旋光度變化和287nm紫外吸收變化變性RNA酶得分?jǐn)?shù)溫度Tm5、DNA熱變性得特征變性過程就是“躍yue變式”得,而非漸變解鏈曲線:連續(xù)加熱DNA,以溫度對(duì)A260作圖,所得得曲線稱為解鏈曲線。指增色效應(yīng)達(dá)50%時(shí)得溫度一般DNATm值在85-90

C之間Tm:DNA變性時(shí),OD260達(dá)到最大值得50%時(shí)得溫度稱為DNA得解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。(1)DNA得均一性:(2)G－C含量:

經(jīng)驗(yàn)公式:XG+C＝(Tm－69、3)×2、44(3)介質(zhì)中得離子強(qiáng)度:

Tm值大小與下列因素有關(guān):(1)DNA得均一性。均質(zhì)DNA,如一些病毒DNA,人工合成得poly(A-T)、poly(G-C)得熔解過程發(fā)生在一個(gè)較小得溫度范圍內(nèi);異質(zhì)DNA得熔解過程發(fā)生在一個(gè)較寬得溫度范圍內(nèi)。Tm大小可反映出DNA得均一性。(2)G-C得含量。G-C得含量高,Tm值高。因而測(cè)定Tm值,可反映DNA分子中G、C含量,可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算:(G+C)%=(Tm-69、3)

2、44(3)介質(zhì)中得離子強(qiáng)度。Tm與介質(zhì)中離子強(qiáng)度有關(guān),一般來說,在離子強(qiáng)度低得介質(zhì)中,DNA得Tm值較低,熔解得范圍較寬。在離子強(qiáng)度高得介質(zhì)中,DNA得Tm值較高,熔解得范圍較窄。DNA得保存應(yīng)在含鹽得緩沖液中溶液得pH

高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵得能力,pH大于11、3時(shí),DNA完全變性pH低于5、0時(shí),DNA易脫嘌呤對(duì)單鏈DNA進(jìn)行電泳時(shí),常在凝膠中加NaOH以維持變性狀態(tài)變性劑與Tm甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵,妨礙堿基堆積,使Tm下降對(duì)單鏈DNA進(jìn)行電泳時(shí),常使用上述變性劑影響熱變性得得Tm(熔解溫度)因素(1)DNA得均一性(2)GC對(duì)含量(3)溶液得離子強(qiáng)度(4)溶液得pH(5)變性劑RNA變性:從螺旋到線團(tuán)之間得轉(zhuǎn)變RNA得變性引起得性質(zhì)變化沒有DNA明顯質(zhì)粒就是原核生物和部分真核生物中獨(dú)立于染色體外得自主復(fù)制得遺傳分子,除酵母得殺傷質(zhì)粒已知就是RNA外,其她均為DNA分子。1963年Bevan等發(fā)現(xiàn)酵母菌株間得相互殺死現(xiàn)象,其嗜殺特性由具有自我復(fù)制能力得細(xì)胞質(zhì)遺傳因子——雙鏈線狀RNA(dsRNA)(占全部核酸得0、1%)決定。同時(shí)dsRNA通常以蛋白質(zhì)外殼包裹著得類病毒顆粒狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。目前研究表明,只有兩種雙鏈RNA與嗜殺現(xiàn)象有關(guān):MdsRNA編碼產(chǎn)生毒素蛋白及決定對(duì)自身毒素得免疫功能(90%以上),LdsRNA編碼自身和外殼主蛋白(6%)(2)核酸得復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)脳l件下,兩條彼此分開得單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu),這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后,一系列性質(zhì)將得到恢復(fù),但就是生物活性一般只能得到部分得恢復(fù)。DNA復(fù)性得程度、速率與復(fù)性過程得條件有關(guān)。將熱變性得DNA驟然冷卻至低溫時(shí),DNA不可能復(fù)性。但就是將變性得DNA緩慢冷卻時(shí),可以復(fù)性。驟然冷卻變性核酸復(fù)性時(shí)需緩慢冷卻,故又稱退火核酸復(fù)性動(dòng)力學(xué)在一定條件下,DNA復(fù)性得速度可以用C0t1/2來衡量影響復(fù)性速度得因素(1)單鏈片段濃度越高,隨機(jī)碰撞得頻率越高,復(fù)性速度越快。(2)較大得單鏈片段擴(kuò)散困難,鏈間錯(cuò)配頻率高,復(fù)性較慢。(3)片段內(nèi)得重復(fù)序列多,則容易形成互補(bǔ)區(qū),因而復(fù)性較快。真核DNA得重復(fù)序列就就是通過復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)得。(4)維持溶液一定得離子強(qiáng)度,消除磷酸基負(fù)電荷造成得斥力,可加快復(fù)性速度

熱變性得DNA在復(fù)性過程中,具有堿基序列部分互補(bǔ)得不同得DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈得現(xiàn)象。核酸分子雜交(hybridization):核酸分子得雜交變性復(fù)性

基于核酸變性和復(fù)性得原理,并依據(jù)堿基間互補(bǔ)配對(duì)得原則而建立得一門技術(shù)。主要用于確定兩種相同或不同得核酸分子間同源性得鑒定變性復(fù)性復(fù)性分子雜交Southern印跡(雜交)Northern印跡(雜交)Western印跡法雜交技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合,能夠檢出含量極低得DNA。一、單項(xiàng)選擇題1、關(guān)于核酸分子組成下列哪項(xiàng)就是正確得A、組成核酸得基本單位就是三磷酸核苷B、組成DNA和RNA得戊糖相同C、組成DNA和RNA得堿基就是相同得D、DNA得二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋E、以上都不對(duì)2、生物體得遺傳信息儲(chǔ)存在DNA得什么部位A、堿基配對(duì)B、某個(gè)核苷酸C、某種核苷D、磷酸戊糖骨架E、堿基順序中3、下列哪個(gè)就是核酸得基本結(jié)構(gòu)單位A、核苷B、磷酸戊糖C、單核苷酸D、多核苷酸E、以上都不就是4、下列何物分子就是C5上有甲基得堿基A、腺嘌呤B、鳥嘌呤C、胞嘧啶D、胸腺嘧啶E、尿嘧啶5、組成DNA分子得磷酸戊糖就是:A、3’-磷酸脫氧核糖B、5’-磷酸脫氧核糖C、3’-磷酸核糖D、2’-磷酸核糖E、5’-磷酸核糖6、嘌呤核苷酸中下列何鍵就是嘌呤與戊糖得連接鍵A、N9—C1'B、N8—C1'C、N1—C1'D、N3—C1'E、N7—C1'7、關(guān)于ATP生理功能得敘述下列哪項(xiàng)就是錯(cuò)誤得A、她就是生物體內(nèi)直接供能物質(zhì)B、可生成環(huán)腺苷酸(cAMP)C、作為物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑D、RNA得合成原料E、以上都不就是8、核酸分子中,單核苷酸連接就是通過下列何化學(xué)鍵A、氫鍵B、糖苷鍵C、3',5'-磷酸二酯鍵D、疏水鍵E、鹽鍵9、下列所述哪個(gè)就是DNA分子得一級(jí)結(jié)構(gòu)A、脫氧核糖核苷酸殘基得排列順序B、各種單核苷酸得連接方式C、雙螺旋結(jié)構(gòu)D、連接單核苷酸間得磷酸二酯鍵E、以上都不就是10、關(guān)于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)得論述下列哪項(xiàng)就是錯(cuò)誤得A、兩條多核苷酸鏈互相平行方向相反B、兩條鏈堿基之間形成氫鍵C、堿基按A—T和G—C配對(duì)D、磷酸和脫氧核糖在內(nèi)側(cè),堿基在外側(cè)E、圍繞同一中心軸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)11、有關(guān)tRNA結(jié)構(gòu)得敘述,下列哪項(xiàng)就是錯(cuò)誤得A、就是RNA中最小得單鏈分子B、其二級(jí)結(jié)構(gòu)通常為三葉草形C、分子中含有較多得稀有堿基D、3’末端就是活化氨基酸得結(jié)合部位E、tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)呈正“L”型12、下列哪個(gè)結(jié)構(gòu)存在于真核生物mRNA5'端A、聚A尾巴B、帽子結(jié)構(gòu)C、超螺旋結(jié)構(gòu)D、核小體E、-C-C-A-OH順序13、下列哪個(gè)結(jié)構(gòu)存在于tRNA3'端A、聚A尾巴B、帽子結(jié)構(gòu)C、超螺旋結(jié)構(gòu)D、核小體E、-C-C-A-OH順序14、下列哪個(gè)結(jié)構(gòu)存在于mRNA3'端A、聚A尾巴B、帽子結(jié)構(gòu)C、超螺旋結(jié)構(gòu)D、核小體E、-C-C-A-OH順序15、下列何構(gòu)型就是溶液中DNA分子最穩(wěn)定得構(gòu)型A、A型B、B型C、C型D、D型E、Z型16、下列何物就是在蛋白質(zhì)合成中作為直接模板A、DNAB、RNAC、mRNAD、rRNAE、tRNA二、多項(xiàng)選擇題1、下列哪些就是維系DNA雙螺旋得主要因素A、鹽鍵B、磷酸二酯鍵C、疏水鍵D、氫鍵E、堿基堆砌作用2、rRNA具有下列哪些結(jié)構(gòu)A、密碼子B、反密碼子C、反密碼環(huán)D、大亞基E、小亞基3、核酸變性可觀察到下列何現(xiàn)象A、黏度增加B、黏度降低C、紫外吸收值增加D、紫外吸收值降低E、磷酸二酯鍵斷裂4、組成核小體得成分有A、DNAB、RNAC、組蛋白D、磷脂E、酸性蛋白5、tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)含有下列哪些成分A、密碼子B、大亞基C、反密碼環(huán)D、