臨床微生物學(xué)下呼吸道感染細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范

臨床微生物學(xué)下呼吸道感染細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范社區(qū)獲得性肺炎常見得病原菌有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡她莫拉菌、肺炎克雷伯菌、軍團(tuán)菌、肺炎支原體及肺炎衣原體等。醫(yī)院獲得性肺炎常見得病原菌有銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和假絲酵母菌等。下呼吸道感染患者可有發(fā)熱、咳嗽和咳痰,痰呈膿性、粘稠或血性,可伴有胸痛、氣急,肺部聞及濕羅音、白細(xì)胞總數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞比例明顯增高,X線檢查提示肺部有炎癥性浸潤或胸腔積液等體癥,嚴(yán)重時可導(dǎo)致感染性休克和呼吸衰竭,因此臨床診斷一般不難;細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)?zāi)苊鞔_感染病原及藥敏結(jié)果,有助于疾病治療、流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)院感染得監(jiān)測。臨床呼吸道標(biāo)本中常見分離細(xì)菌見表1

一、送檢指征痰液標(biāo)本就是臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)最常見得標(biāo)本,但不就是下呼吸道感染得最佳標(biāo)本。1、咳嗽咳嗽咳痰就是下呼吸道感染最常見得癥狀,咳嗽得性質(zhì)與痰得性狀如膿或鐵銹樣痰具有鑒別診斷意義。2、咯血喉以下得呼吸道出血為咯血,包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等3、呼吸困難呼吸急促或哮喘,常伴有胸痛4、發(fā)熱伴白細(xì)胞增高尤其就是中性粒細(xì)胞或CRP明顯增高5、胸部影像學(xué)檢查提示有感染可能二、標(biāo)本采集與驗(yàn)收對可疑烈性呼吸道傳染病(如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等)得患者采集檢驗(yàn)標(biāo)本時必須注意生物安全防護(hù)。痰液就是臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)最常見得標(biāo)本,但不就是下呼吸道感染得最佳標(biāo)本。(一)標(biāo)本采集方法1、自然咳痰法以晨痰為佳,采集標(biāo)本前應(yīng)用清水、冷開水漱口或牙刷清潔口腔和牙齒,有假牙者應(yīng)取下假牙。盡可能在用抗菌藥物之前采集標(biāo)本。用力咳出呼吸道深部得痰,痰液直接吐入無菌、清潔、干燥、不滲漏、不吸水得廣口帶蓋得容器中,標(biāo)本量應(yīng)≥1ml?？忍道щy者可用霧化吸入加溫至45℃得100g/LNaCl水溶液,使痰液易于排出。對難于自然咳痰患者可用無菌吸痰管抽取氣管深部分泌物。標(biāo)本應(yīng)盡快送檢,不能及時送檢得標(biāo)本,室溫保存≤2h。2、支氣管鏡采集法、防污染毛刷采集法、環(huán)甲膜穿刺經(jīng)氣管吸引法、經(jīng)胸壁針穿刺吸引法和支氣管肺泡灌洗法,均由臨床醫(yī)生按相應(yīng)操作規(guī)程采集,但必須注意采集標(biāo)本時盡可能避免咽喉部正常菌群得污染。

3、小兒取痰法用彎壓舌板向后壓舌,將拭子伸入咽部,小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時,可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上送檢。幼兒還可用手指輕叩胸骨柄上方,以誘發(fā)咳痰。

(二)標(biāo)本驗(yàn)收與拒收遇有不合格標(biāo)本,應(yīng)及時與臨床聯(lián)系,報告不合格標(biāo)本拒收得具體理由。下呼吸道標(biāo)本驗(yàn)收與拒收見下。

1、

呼吸道有大量得正常菌群存在,咽試子、咳痰、吸出得分泌物厭氧菌培養(yǎng)無意義。

2、

申請單填寫應(yīng)完整。標(biāo)本標(biāo)識必須唯一,并與申請單相符,未標(biāo)采集時間、部位或檢驗(yàn)要求等拒收。

3、

痰標(biāo)本呈水樣或唾液樣,拒收。4、

標(biāo)本涂片白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù):白細(xì)胞數(shù)＜10/低倍鏡和鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)＞25/低倍鏡,表示該標(biāo)本已污染正常菌群,建議重送標(biāo)本。

5、

標(biāo)本容器必須符合規(guī)定,溢漏、無蓋者拒收。

6、

送檢時間超過2h拒收。

7、

同時同部位或同一天兩份相同檢測得標(biāo)本(應(yīng)與申請醫(yī)師協(xié)商處理)。

大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)室檢查(一)肉眼觀察觀察痰液得顏色、粘度、有無血絲和就是否呈膿性,如見有顆粒存在,則應(yīng)注意可能與放線菌屬及奴卡菌屬感染有關(guān)。

(二)顯微鏡檢查下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)得標(biāo)本均需涂片革蘭染色進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和細(xì)菌學(xué)顯微鏡檢查,其目得就是判別送檢標(biāo)本就是否適合做細(xì)菌培養(yǎng),并初步判定有否病原菌、病原菌得數(shù)量及其類別,有助于初步報告、選擇培養(yǎng)基和對培養(yǎng)結(jié)果得綜合分析。

推薦判別標(biāo)本合格得標(biāo)準(zhǔn)見表2

近年來推薦簡單得方法就是痰標(biāo)本涂片鏡檢＞10個白細(xì)胞/低倍鏡時,就可判斷就是基本合格并可用于細(xì)菌培養(yǎng)得標(biāo)本,尤其就是白細(xì)胞減少得患者。

油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)、排列和染色性,可初步推定菌屬(或種),涂片中所見細(xì)菌得量及吞噬細(xì)胞內(nèi)就是否有細(xì)菌等。如發(fā)現(xiàn)酵母樣菌、菌絲、孢子和放線菌或奴卡菌等,應(yīng)予相應(yīng)報告和按要求做相應(yīng)得檢查。(三)分離培養(yǎng)1、痰標(biāo)本培養(yǎng)前處理不含或含粘液很少得合格標(biāo)本,可直接接種,遇有含大量粘液得標(biāo)本,應(yīng)加入等量得液化劑(如pH7、6得10g/L胰酶溶液等),放置35℃待充分液化再行接種。亦可加液化劑后用旋轉(zhuǎn)混勻器攪拌混勻,3000r/min離心10min棄上清液,取沉淀物接種培養(yǎng)基。

2、一般細(xì)菌培養(yǎng)(1)一般細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)同時劃區(qū)接種:

1)血平板適用于分離肺炎鏈球菌和其她細(xì)菌。

2)加抗生素得巧克力平板適用于分離嗜血桿菌。

3)麥康凱/中國蘭平板適用于分離革蘭陰性桿菌。

(2)分離培養(yǎng)血平板和巧克力平板需置5%CO2環(huán)境,麥康凱平板/中國蘭平板,35℃孵育。

3、挑取可疑菌落進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn),痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本易受到上呼吸道正常菌群得污染,臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常可從送檢得呼吸道標(biāo)本中分離出多種細(xì)菌,但分離細(xì)菌就是否能真正代表下呼吸道感染得病原菌,這對臨床診斷與治療感染性疾病至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室人員在檢驗(yàn)過程中應(yīng)重視判斷所分離得細(xì)菌就是污染得上呼吸道正常菌群還就是引起下呼吸道感染得病原菌。在實(shí)際工作中,有時也由于細(xì)菌生長速度不一,如肺炎鏈球菌可能被生長速度快得細(xì)菌(包括正常菌群)菌落掩蓋,不仔細(xì)觀察就會忽略檢驗(yàn)。當(dāng)在同一培養(yǎng)基上分離出多種病原菌(復(fù)合菌)時,應(yīng)主動與臨床醫(yī)師聯(lián)系,結(jié)合患者得臨床癥狀、痰涂片染色鏡檢及近期細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果(如近期同一病人多次分離培養(yǎng)出同一種菌)等綜合判斷所分離得多種細(xì)菌中哪一種菌可能為優(yōu)勢病原菌。當(dāng)分離優(yōu)勢菌與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時,優(yōu)勢菌必需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。若分離培養(yǎng)結(jié)果與涂片染色鏡檢結(jié)果不相符時,或少量生長優(yōu)勢可疑病原菌時,也需做藥敏試驗(yàn),但在報告中提示,此結(jié)果請結(jié)合臨床和涂片所見進(jìn)行分析。痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本檢驗(yàn)流程見下圖。

圖1痰及下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)得操作流程

四、結(jié)果報告(一)下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果報告由于檢驗(yàn)結(jié)果報告得時效性,下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果分為初步和最終結(jié)果報告。

1、初步報告應(yīng)包括標(biāo)本涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告(發(fā)現(xiàn)有診斷價值時應(yīng)及時向臨床口頭報告,并作相關(guān)紀(jì)錄);

(1)涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告:如鏡檢見到排列成葡萄狀得革蘭陽性球菌,可報告“找到革蘭陽性球菌,形似葡萄球菌”;如見到瓜子仁形成矛頭狀端相背,成雙排列,具有明顯莢膜得革蘭陽性球菌時,可報告“找到革蘭陽性球菌,形似肺炎鏈球菌”;如見到不易識別得細(xì)菌時則報告“找到革蘭×性×形細(xì)菌”;如檢見其她病原菌應(yīng)主動描述性得報告觀察結(jié)果,并與臨床聯(lián)系和追蹤進(jìn)一步檢查。

(2)白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)得描述性報告:包括白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)/低倍鏡、細(xì)胞內(nèi)有否含有細(xì)菌和胞內(nèi)細(xì)菌染色及形態(tài)學(xué)特性。2、最終結(jié)果報告應(yīng)包括送檢標(biāo)本肉眼觀察得結(jié)果、涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告、分離致病菌得鑒定結(jié)果、藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

(1)痰標(biāo)本涂片革蘭染色后白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢未發(fā)現(xiàn)有臨床診斷意義結(jié)果(可不用初步報告):細(xì)菌分離培養(yǎng)為正常菌群時,最終檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)報告“正常菌群”生長。若無菌生長應(yīng)報告經(jīng)48小時培養(yǎng)無細(xì)菌生長,有意義得培養(yǎng)基(巧克力平板、血平板),再置2天仍無生長可棄之。但對偶然分離得“優(yōu)勢可疑病原菌”,還需做藥敏試驗(yàn),并及時與臨床聯(lián)系,最終檢驗(yàn)報告應(yīng)包括標(biāo)本肉眼觀察結(jié)果,涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)及細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告,細(xì)菌鑒定得規(guī)范細(xì)菌名稱和藥敏試驗(yàn)結(jié)果。但應(yīng)提示所報告得結(jié)果請結(jié)合臨床進(jìn)行分析。

(2)標(biāo)本涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢發(fā)現(xiàn)有診斷價值時,細(xì)菌分離培養(yǎng)檢出優(yōu)勢菌,并與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時,除及時初步報告外,最終檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)報告標(biāo)本肉眼觀察得結(jié)果、涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告、優(yōu)勢菌鑒定得規(guī)范細(xì)菌名稱和藥敏試驗(yàn)結(jié)果等。細(xì)菌分離培養(yǎng)未檢出優(yōu)勢菌,通常提示可能厭氧菌感染、大量應(yīng)用抗菌藥物、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法或送檢標(biāo)本保存和運(yùn)送不當(dāng)?shù)仍颉８戒?、放線菌及奴卡菌涂片檢查:將痰液用生理鹽水洗滌數(shù)次,然后挑取黃色顆粒(硫磺顆粒)或不透明得著色斑點(diǎn),置載玻片上覆以蓋玻片,輕輕擠壓,置高倍鏡下觀察,如見中央為交織得菌絲,其末端較粗桿形呈放線狀排列,揭去蓋玻片,干后作革蘭及抗酸染色鏡檢。

(1)如鏡檢見有中間部份得菌絲為革蘭陽性,而四周放射得末梢菌絲為革蘭陰性,抗酸染色為非抗酸性菌,可報告送檢標(biāo)本肉眼觀察得結(jié)果和細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告“直接涂片找到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外大量或少量革蘭陽性桿菌型似放線菌”。(2)如鏡檢見有革蘭染色反應(yīng)及形態(tài)學(xué)特性與放線菌相似,但抗酸染色為弱抗酸性時可報告送檢標(biāo)本肉眼觀察得結(jié)果和細(xì)菌學(xué)鏡檢得描述性報告“直接涂片找到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外大量或少量似奴卡菌”。

2、結(jié)核分枝桿菌涂片檢查與培養(yǎng):見“操作規(guī)范”有關(guān)章節(jié)。

3、厭氧菌、真菌、支原體、衣原體等檢驗(yàn)見“操作規(guī)范”有關(guān)章節(jié)。4、嗜肺軍團(tuán)菌檢查

(1)

標(biāo)本選擇:以氣管穿刺抽出液,胸腔液或肺、肝組織為好,最好不用痰標(biāo)本。

(2)

標(biāo)本處理:必須在生物安全柜內(nèi)操作,操作者必須戴口罩及手套。

①

液體標(biāo)本:如胸腔液或氣管穿刺液,不需處理,可直接接種到BCYE平板,血平板、巧克力平板。

②

固體標(biāo)本:如肺、肝、脾等需經(jīng)處理,1份組織加9份磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7、2)制成10%混懸液,如液體標(biāo)本接種。

③

環(huán)境標(biāo)本:以冷氣機(jī)之冷卻水為標(biāo)本,可取3-5升得冷卻水以過濾法(用0、45μm孔徑濾膜)過濾后,將濾膜取出經(jīng)酸液洗滌后,按上法接種。(3)

培養(yǎng)鑒定:將接種好得BCYE平板,血平板和巧克力平板,35℃2-5%CO2環(huán)境培養(yǎng),底部必須放濕紙巾,以防培養(yǎng)基干燥。每天檢查培養(yǎng)基生長情況,如生長,革蘭染色鏡檢,如無發(fā)現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng),直至2星期。如生長在BCYE平板,而不生長血平板,巧克力平板,可能為軍團(tuán)菌,應(yīng)進(jìn)一步鑒定。如生長在血平板,巧克力平板,則非軍團(tuán)菌。

(4)

直接涂片檢查:以Dieterle鍍銀染色法染色,也可用改良革蘭染色法(用Carbolfuchsin代替Safranhe作復(fù)染液)可得到甚好結(jié)果。(5)

其她檢查:有直接熒光抗體染色法(DFA)檢查標(biāo)本中抗原,E