氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的保護作用

氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的保護作用目的研究鹽酸氨溴索注射液（氨溴索）對百草枯（PQ）中毒肺纖維化的影響及相關機制。方法將105只SD大鼠隨機分為5組：正常對照組（NC組）、百草枯中毒組（PQ組）、氨溴索普通劑量治療組（PN組）、氨溴索大劑量治療組（PL組）、氨溴索超大劑量治療組（PE組），采取腹腔注射法構建動物模型：NC組注射1.25mg/kg生理鹽水；PQ組注射25mg/kg2%PQ溶液；PN組注射25mg/kg2%PQ溶液+30mg/（kg·d）氨溴索；PL組注射25mg/kg2%PQ溶液+50mg/（kg·d）及PE組注射25mg/kg2%PQ溶液+90mg/（kg·d）。在模型建立后21d處死動物，肺組織行HE和Masson染色分別觀察炎癥以及纖維化情況；ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Westernblot分別測定肺組織中組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表達。結果NC組肺組織正常，百草枯模型組大鼠肺損傷和肺組織膠原沉積明顯。各劑量氨溴索治療均能顯著減少百草枯中毒誘導的大鼠肺組織膠原沉積，同時伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表達的顯著下降（P40%，得4分；每組切片觀察4個高倍鏡，最后取平均值為肺纖維化得分。1.6qRT-PCR法檢測肺組織TNF-α和TIMP-1的mRNA表達運用qRT-PCR法檢測右肺組織中TNF-α和TIMP-1的mRNA表達，具體按試劑盒說明進行。TNF-α和TIMP-1表達的相對值=2-△△Ct。TNF-α引物：（F）5’-GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3’和（R）5’-TGT？鄄GGGTGAGGAGCACATAG-TC-3’；TIMP-1引物：（F）5’-ATCGCTCTGGTAGCCCTTCT-3’和（R）5’-TCCCA？鄄GA-AATCATCGAGAC-3’。以U6為內參，每組實驗重復3次。1.7Westernblot檢測組織TNF-α和TIMP-1蛋白的表達采用Westernblot檢測右肺組織中TNF-α和TIMP-1蛋白的表達情況，具體按試劑盒說明進行。以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。1.8統計學方法采用統計軟件SPSS19.0對數據進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P0.05）。見表3。3討論百草枯中毒大鼠肺的病理改變包括早期急性肺炎和后期肺纖維化，炎性細胞的浸潤和炎性因子的釋放是其重要的病理特征，IL-6、TNF-α和TIMP-1等細胞因子在肺纖維化的發(fā)病及病理過程中的作用已引起廣泛的重視[4，9]。筆者發(fā)現，在百草枯中毒后第21天后，大鼠肺組織不僅存在肺損傷，同時伴有肺組織大量膠原沉積，并伴有TIMP-1、TNF-α和IL-6表達的增加，這與Nakamura等[10]的研究是一致的，說明百草枯中毒后期出現廣泛的肺纖維化。鹽酸氨溴索具有抗炎、抗氧化和促進肺泡表面活性物質釋放等作用，能夠減輕放射性、內毒素等所致的急性肺損傷[11-12]。本研究主要發(fā)現，氨溴索能夠減輕百草枯中毒所導致的肺損傷和肺膠原的沉積，同時降低TIMP-1、TNF-α和IL-6的水平，提示氨溴索對于百草枯中毒所致的急性肺損傷及后期的纖維化有一定的保護作用。TNF-α與肺纖維化和肺間質炎癥密切相關，在肺纖維化中起重要作用[13-14]。IL-6具有廣泛的生物學功能，在肺纖維化過程中，大量增生的淋巴細胞、巨噬細胞以及成纖維細胞可以產生大量的IL-6，導致IL-6水平的升高[15-17]。本研究發(fā)現氨溴索能夠降低TNF-α和IL-6的表達，提示氨溴素對百草枯中毒所致的后期肺纖維化的保護作用可能與這兩個細胞因子相關。急性百草枯中毒患者由肺損傷漸進發(fā)展為肺間質纖維化，其發(fā)生發(fā)展與TIMP-1的表達相關，研究結果顯示百草枯中毒后導致TIMP-1水平升高，考慮為中毒后肺泡內皮、上皮細胞受損，釋放一系列細胞因子和炎性遞質，促進基質金屬蛋白酶合成與活化，從而參與細胞外基質和基底膜的降解，導致急性肺損傷[18-20]。而中毒后期，TIMP-1仍持續(xù)高于正常，此時，TIMP-1的表達占優(yōu)勢，參與肺纖維化的進展[21-22]。本研究發(fā)現肺纖維化程度越高，TIMP-1的表達越高，而氨溴索干預后可以明顯降低TIMP-1的表達。綜上所述，本研究發(fā)現氨溴索能夠減緩急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺組織纖維化，這種作用與TIMP-1、TNF-α以及IL-6相關。因而，氨溴索對急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺纖維化有一定的保護作用，值得進一步研究。[參考文獻][1]KervégantM，MerigotL，GlaizalM，etal.ParaquatpoisoningsinFranceduringtheEuropeanban：experienceofthePoisonControlCenterinMarseille[J].JMedToxicol，2013，9（2）：144-147.[2]陳麗，錢潔，葉延，等.百草枯反復小劑量腹腔給藥誘導小鼠肺纖維化模型[J].中華急診醫(yī)學雜志，2011，20（12）：1285-1289.[3]梁笛.化痰藥物氨溴索的非化痰作用研究進展[J].復旦學報：醫(yī)學版，2011，11，389（6）：554.[4]田同德，楊峰，唐靜雯，等.清熱活血散結復方對放射性肺炎及肺纖維化血清細胞因子IL-6，TNF-α，TGF-β1水平的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2014，5（4）：127-130.[5]章巍，劉新民，李海潮，等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織MMP-2、MMP-9、MT1-MMP及TIMP-1、TIMP-2的表達[J].北京大學學報：醫(yī)學版，2002，34（6）：716-721.[6]萬勇，張念，李劍平，等.調節(jié)性T細胞與Th17細胞的失衡及其對大鼠肺纖維化的影響[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2013，42（2）：161-166.[7]馬玉騰.大劑量氨溴索治療百草枯中毒所致急性肺損傷的實驗研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2004.[8]FulmerJD，BienkowskiRS，CowanMJ，etal.Collagenconc？鄄entrationandratesofsynthesisinidiopathicpulmonaryfibrosis[J].AmRevRespirDis.1980，Aug，122（2）：289-301.[9]HillRP，ZaidiA，MahmoodJ，eta1.Investigationsintotheroleofinflammationinnormaltissueresponsetoirradiation[J].RadiotherOncol，2011，101（1）：73-79.[10]NakamuraT，UshiamaC.ChangesinconcentmtionsoftypeⅣcoUagenandtissueinhmitorofmetalloproteinase-1inpatientswithpanquatpoisoning[J].ApplToxicol，200l，21（6）：445-447.[11]蔡洪流，朱紅，李立斌.大劑量鹽酸氨溴索對大鼠內毒素性肺損傷保護作用的實驗研究[J].中國急救醫(yī)學，2006，26（8）：605-606.[12]李曉平，張衛(wèi)東，姜濤，等.大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺損傷后TLR-4/nF-κB的作用研究[J].中華老年醫(yī)學雜志，2016，35（6）：647-650.[13]熊紅，江漢華，楊開云.銀杏葉提取物對肺纖維化模型大鼠血清中TNF-α、IL-6表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（8）：2063-2064.[14]謝宗賢，徐兵，王繁麟，等.百草枯大鼠肺組織炎癥因子TNF-α和IL-6的表達和水楊酸鈉的干預作用[J].中華急診醫(yī)學雜志，2015，24（7）：768-771.[15]王貴富，王寶中，盛延興，等.小鼠早期放射性肺損傷組織中單核細胞趨化蛋白1的表達及其意義[J].腫瘤研究與臨床，2016，28（6）：369-372.[16]張敏，顏培夏，吳曉燕，等.跨肺壓法設置呼氣末正壓通氣對急性呼吸窘迫綜合征模型豬肺保護作用的研究[J].中華重癥醫(yī)學電子雜志：網絡版，2016，2（1）：50-58.[17]唐懌，安慶寶，付守芝，等.大鼠機械式胸外按壓心肺復蘇模型的建立[J].中國實驗動物學報，2016，24（6）：632-638，658.[18]謝同林，王方，謝成明，等.MMP-9、TIMP-1在羊水栓塞大鼠模型的表達及意義[J].遵義醫(yī)學院學報，2016，39（1）：22-25.[19]張琳，何岱昆，邵義如，等.褪黑素對光氣吸入性肺損傷中p38MAPK信號通路的影響[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2014，32（9）：648-652.[20]郭民，樊林花，