琥珀酸脫氫酶

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)四酶的競爭性抑制問題1：本次實(shí)驗(yàn)提取的是什么酶？問題2：該酶位于細(xì)胞的什么部位？催化什么化學(xué)反應(yīng)？琥珀酸脫氫生成延胡索酸:

琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸(fumarate)琥珀酸(succinate)問題3：如何檢測琥珀酸脫氫酶的活性狀況？在體內(nèi),琥珀酸脫下的2H經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放出能量。在體外可利用甲烯蘭(藍(lán)色)作為人工受氫體，接受琥珀酸脫下的2H而被還原為甲烯白(無色)。藍(lán)色消褪的快慢可顯示琥珀酸脫氫酶的活性。問題4：何為競爭性抑制？問題5：本次實(shí)驗(yàn)中的抑制劑是什么？為何選擇該物質(zhì)作為抑制劑？問題6：如何設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案檢測酶被抑制的程度？競爭性抑制：分子結(jié)構(gòu)與底物相似的抑制劑與底物競爭結(jié)合酶的活性中心，抑制酶活性。Ki：EI的解離常數(shù)，抑制常數(shù)EI不能轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物草酸、丙二酸與琥珀酸分子結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。COOCOOOxalate

酶被抑制的程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例。

可依據(jù)藍(lán)色消褪的時間判斷酶活性被抑制的程度。Theeffectofacompetitiveinhibitorcanbeovercomewithhighconcentrationsofthesubstrate離心技術(shù)利用物體高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體（離心機(jī)）中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。離心機(jī)轉(zhuǎn)子從靜止?fàn)顟B(tài)加速旋轉(zhuǎn)如果顆粒密度＞周圍介質(zhì)的密度，則顆粒離開軸心方向移動，即發(fā)生沉降；如果顆粒密度＜周圍介質(zhì)的密度，則顆粒朝向軸心方向移動，即發(fā)生漂浮。在離心場中，作用于顆粒上的力主要有離心力Fc、浮力FB和摩擦阻力Ff。離心力轉(zhuǎn)速（revolutionsperminute，rpm）相對離心力（relativecentrifugalforce,RCF）：是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)，×g

RCF＝1.118×10-5RN2

R為離心轉(zhuǎn)子的半徑（cm），N為轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)/分）低速離心常以rpm表示超速離心以×g表示。離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的列線圖轉(zhuǎn)子半徑相對離心力轉(zhuǎn)速相對離心力的計算為了便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，制作了離心轉(zhuǎn)子的半徑、轉(zhuǎn)速和相對離心力三者關(guān)系的列線計算圖。離心機(jī)的分類目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類繁多，按其離心轉(zhuǎn)子所能達(dá)到的最高轉(zhuǎn)速分為：低速離心機(jī)(在6,000rpm以下)高速離心機(jī)(在25,000rpm以下)超速離心機(jī)(在30,000rpm以上)目前商售大型超速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速達(dá)100,000rpm，相對離心力達(dá)803,000×g。

低速離心機(jī)臺式高速冷凍離心機(jī)超速冷凍離心機(jī)離心機(jī)轉(zhuǎn)子常用的離心機(jī)轉(zhuǎn)子有三種：(1)固定角度轉(zhuǎn)子(fixed-anglerotor)；(2)水平轉(zhuǎn)子(swing-outrotor或swing-backetrotor)；(3)垂直轉(zhuǎn)子(verticalrotor)。轉(zhuǎn)子通常用(鋁)合金、鋁(鎳)合金或塑料制成。鈦合金轉(zhuǎn)子雖然價格昂貴，加工困難，比較笨重，但它強(qiáng)度大，耐用，能經(jīng)受冷凍及高溫消毒處理，抗化學(xué)腐蝕和應(yīng)變侵蝕的性能強(qiáng)，是當(dāng)前最理想的轉(zhuǎn)子。離心操作注意事項(xiàng)1．精密平衡2．對稱放置3．鎖定蓋子4．限速運(yùn)轉(zhuǎn)確認(rèn)所用轉(zhuǎn)子最大額定速度，離心機(jī)不能超過最大額定速度的75%。5．停轉(zhuǎn)開蓋6．選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)子一般離心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替離心管。液體不能裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或被腐蝕。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)動物的處死方法學(xué)習(xí)動物組織勻漿法學(xué)習(xí)離心機(jī)的使用方法了解琥珀酸脫氫酶的作用，進(jìn)一步理解酶的競爭性抑制原理酶競爭性抑制實(shí)驗(yàn)所需試劑1、pH7.4磷酸緩沖液2、0.25％琥珀酸鈉溶液3、0.5％草酸鈉溶液4、0.01％甲烯蘭溶液小鼠的抓取保定

小鼠性情較溫順，掙扎力小，比較容易抓取和保定。抓取時，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如圖11-3所示）放在格板或鐵籠上。趁著小鼠試圖掙脫的瞬間，迅速用另外三個手指壓住小鼠的尾巴根部握入手掌（如圖11-4所示）；放松拇指和食指，用另外三個手指控制小鼠，然后用食指和拇指捏住小鼠頭部兩邊疏松的皮膚提起小鼠（如圖11-5所示），完成抓取保定。頸椎脫臼處死法處死小鼠

將實(shí)驗(yàn)動物的頸椎脫臼，斷離脊髓致死，為大、小鼠最常用的處死方法。操作時用左手拇指、食指用力向下按壓鼠頭及頸部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成頸椎脫臼，脊髓與腦干斷離，實(shí)驗(yàn)動物立即死亡。注意:

實(shí)驗(yàn)人員的安全；確認(rèn)實(shí)驗(yàn)動物已經(jīng)死亡；妥善處理好尸體。肝臟組織勻漿法勻漿的方式手工勻漿機(jī)器勻漿：組織搗碎勻漿器超聲勻漿：超聲粉碎機(jī)反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)步驟1、肝糜液的制備：取小白鼠一只，頸椎脫臼法處死，立即剖腹將肝臟全部取出（為何選肝臟？），置于研缽中，用生理鹽水洗凈肝臟中血液。用剪刀剪碎肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批加入少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共加入7ml。

（分幾次加入，每次加入后均需充分研磨。）注意：此步一定要研磨充分（酶位于線粒體內(nèi)膜上）。研至勻漿后倒入離心管中，離心4分鐘(3000轉(zhuǎn)/分)。將上清液轉(zhuǎn)入另一試管中備用。此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。試

劑1號管2號管3號管4號管5號管0.25％琥珀酸鈉液0.50—0.502.000.500.5％草酸鈉液—0.500.500.502.00蒸餾水2.002.001.50——肝糜液1.001.001.001.001.00甲烯藍(lán)5滴5滴5滴5滴5滴2、另取中試管五支，標(biāo)號，按下表操作(單位為ml)：搖勻(