《DNA片段的PCR擴(kuò)增》教案

4/4實(shí)驗(yàn)13DNA片段的PCR擴(kuò)增【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.了解PCR技術(shù)的操作原理與方法。2.進(jìn)行DNA片段的PCR擴(kuò)增?！窘虒W(xué)重點(diǎn)】PCR的原理和PCR的基本操作【教學(xué)難點(diǎn)】PCR的原理【教學(xué)方法】運(yùn)用“指導(dǎo)——?jiǎng)?chuàng)新”實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式。這種教學(xué)模式的基本含義是：以實(shí)驗(yàn)活動(dòng)為基礎(chǔ)，以改進(jìn)、完善、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)為切入點(diǎn)，發(fā)展學(xué)生的創(chuàng)新能力、培養(yǎng)學(xué)生積極的個(gè)性特征和科學(xué)態(tài)度【教學(xué)過程】（一）引入新課在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測(cè)、古生物鑒定等都離不開對(duì)DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)――PCR技術(shù)。（二）進(jìn)行新課1.基礎(chǔ)知識(shí)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似：1.1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3’端起點(diǎn)1.2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程（1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖）由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長(zhǎng)鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)：（2）DNA的復(fù)制過程:解旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。引物結(jié)合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對(duì)結(jié)合，確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對(duì)。DNA聚合酶結(jié)合：子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈）子鏈合成特點(diǎn)：不能從頭合成；合成方向?yàn)椤?’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對(duì)功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對(duì)無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對(duì)功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯(cuò)配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。［思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對(duì)；DNA聚合酶的復(fù)查功能。［思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。1.3DNA分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80～100℃時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴?fù)螺旋：在50℃左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。反應(yīng)場(chǎng)所：PCR儀（自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。［思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）4.PCR的反應(yīng)過程延伸復(fù)性變性延伸復(fù)性變性變性：在95℃復(fù)性：在50℃時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合延伸：在72℃時(shí)合成DNA子鏈（兩個(gè)引物間的序列）2.實(shí)驗(yàn)操作2.1標(biāo)記好3個(gè)0.5ml微量離心管，依照課本P68表依次加入試劑，關(guān)閉上蓋并在振蕩器上震蕩20s，使之混合均勻。2.2將3個(gè)微量離心管放到固定器上，保證每管中的液面在水浴中的水面以下，依照課本P68時(shí)間表依次放入3個(gè)水浴進(jìn)行PCR。有條件的可用PCR儀，將微量離心管放到PCR的管架上。2.3電泳。將TBE緩沖液加入到電泳槽中，使緩沖液高出凝膠面3-4mm，再將20μl藍(lán)色的緩沖液充分混勻后，加到凝膠板的加樣孔中。另取3支微量離心管嗎，標(biāo)記管號(hào)，分別加入20μlPCR產(chǎn)物和2μl藍(lán)色加樣緩沖液?；旌虾蠓謩e加到3個(gè)凝膠板上的小池中，然后進(jìn)行電泳。如果用18V電池約進(jìn)行電泳4-6h，如用直流電泳儀電源，80V電泳40min。2.4電泳后將凝膠緩沖液倒出，緩沖液可再利用。將10ml染色液（亞甲藍(lán)）覆蓋在凝膠表面，15-20min后，移去染色劑，再加入5ml70％乙醇，不斷搖動(dòng)1-2min，使乙醇分布均勻，再除去乙醇，加入冷水，幾分鐘后看到藍(lán)色的區(qū)帶出現(xiàn)，這就是擴(kuò)增的DNA。從圖譜中也可看出12個(gè)循環(huán)和14個(gè)循環(huán)之間的擴(kuò)增量的區(qū)別?！菊n余作業(yè)】1.PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別？2.如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？【教學(xué)體會(huì)】教師在教學(xué)過程中，可以先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識(shí)，在此基礎(chǔ)上，學(xué)生可加深對(duì)于PCR原理的認(rèn)識(shí)。對(duì)于PCR反應(yīng)過程的教學(xué)，應(yīng)以讀圖識(shí)圖為主。教材中反應(yīng)過程圖解詳細(xì)的描繪了