生物醫(yī)藥基地western blot技術手冊

生物醫(yī)藥基地westernblot技術手冊

1.westernblot主要試劑的配方

1.15義電泳緩沖液配方(IL)

Tris-Base15.1g

甘氨酸(Glycine)94g

SDS5g

留意事項：

a.加水時應盡量避開氣泡的產(chǎn)生，否則會造成過多SDS的損耗。

b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用時用純水稀釋至IX使用。

1.2IX轉(zhuǎn)膜液配方［1L)

甘氨酸(Glycine)2.9g

Tris-Base5.8g

SDS0.37g

甲醇200ml

留意事項：

a.參加適量的純水，用磁力轉(zhuǎn)子將各組分溶解后參加甲醇溶液，最終

用純水定容至1L(甲醇氣味大，通風廚內(nèi)配制，并留意戴口罩)。

b.加水時應盡量避開氣泡的產(chǎn)生，否則會造成過多SDS的損耗。

1.310XTBS配方UL)

Tris-Base24.2g

NaCl80g

留意事項：

參加適量的純水溶解各組分后，使用濃鹽酸或濃氫氧化鈉溶液調(diào)整

溶液的PH至7.6(一般溶解后溶液是偏堿的，所以選用濃鹽酸調(diào)整

PH至7.6即可)。

b.使用PH計調(diào)整溶液的PH前，要依據(jù)說明書校準PH計。

c.PH調(diào)整至7.6后，用純水定容至1L,使用時稀釋10倍至1義使用。

d.配制TBST時，在1XTBS中依據(jù)1:1000的比例參加吐溫20充分

混勻即可。

1.430%丙烯酰胺單體儲存液配方(100ml)

丙烯酰胺(Acrylamide)29g

N,N、?亞甲雙丙烯酰胺

(N,N'-MethyleneBisacrylamide)1g

留意事項:

a.將各組分溶于總體積為60ml的純水中，加熱至37C完全溶解，用

純水定容至100ml。

b.用裝0.45|im膜的濾器過濾，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。

c.丙烯酰胺有神經(jīng)毒性，操作時戴手套，并留意不要造成試驗臺面

等的污染。

1.5上液(IMTris-HClPH=6.8)配方(50ml)

Tris-Base6.057g

三蒸水40ml

留意事項：用濃鹽酸調(diào)整PH至6.8,再用三蒸水定容至50ml,4℃冰

箱保存。

1.6下液fIMTris-HCl,pH8.8)[50ml)

Tris-Base9.08g

三蒸水40ml

留意事項：用濃鹽酸調(diào)整PH至8.8,再用三蒸水定容至50ml,4℃冰

箱保存。

2.WesternBlot主要流程

2.1蛋白樣品的提取

2.1.1常用裂解液及其特點

產(chǎn)品編號POO13P00J3BP00I3CP0013DP0013EP0013G

Western及IP

產(chǎn)品名稱RIPA裂解液（強）RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NPT0裂解液SDS裂解液

細胞裂解液

1%NP-40,

1%TritonX-1%TritonX-100,1%1%NP-4O,0.5%

有效裂解成分0.25%!%NP-401%SDS

100deoxycholate,0.1%SDSdeoxycholate,0.1%SDS

deoxycholate

裂解強度溫和強中溫和溫和強

對膜蛋白的提取一般很好較好一般一般很好

對胞漿蛋白的提取很好很好很好很好很好很好

對核蛋白的提取較好很好較好較好較好很好

胞漿磷酸化素門提取很好很好很好很好很好很好

細胞核轉(zhuǎn)錄因子提取很好很好很好很好很好很好

含蛋白酶抑制劑是是是是是是

含磷酸酯酶抑制劑是是是是是足

主要用途W(wǎng)B,IP.co-lPWB,IPWB.IPWB,IP,co-IPWB,IP.co-IPWB.ChIP

2.1.2醫(yī)藥基地常用蛋白質(zhì)提取方法

（1）RIPA強裂解法：

a.取適量胰酶消化細胞［針對對貼壁細胞，懸浮細胞可省略此步），

收取細胞，PBS洗兩遍，600g離心5min,盡量去除PBS,向細胞沉

淀中參加適量的預加了蛋白醐抑制劑PMSF的RIPA強裂解液（803

——200ul不等，依據(jù)自己細胞量的多少定）。

b.冰上裂解40min,每5min猛烈渦旋一次。

c.充分裂解后，14000rpm,4℃離心15min,將上清轉(zhuǎn)至另一預冷的

EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

留意事項：

a.整個過程盡量在冰上操作，由于蛋白在常溫降解速度很快，而在

冰上則能顯著的減慢這一過程。

b.PMSF有毒，留意戴手套，并留意不要造成試驗臺面等的污染。

（2）SDS煮沸法（此方法對Caspase家族切割條帶具有特效）：

a.收取細胞，PBS洗兩遍，600g離心5min,盡量去除PBS。

b.向細胞沉淀中參加適量的預加了蛋白酶抑制劑PMSF的SDS裂解

液（80ul—2003不等，依據(jù)自己細胞量的多少定）。

c.將EP管放在加熱器上95-100℃加熱20min以上，加熱至樣品中的

核酸粘稠物（細胞內(nèi)核酸）完全溶解為止。

d.充分裂解后，14000rpm,4℃離心15min,將上清轉(zhuǎn)至另一預冷的

EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

留意事項：

a.由于加熱的溫度很高為95℃,煮沸的全過程中，不要離開蛋白樣

品，防止EP管炸開而損失蛋白樣品，甚至蛋白樣品被蒸干。具體技

巧與方法：放物體壓住EP管，待加熱時間快完畢時，停頓加熱，冷

卻到肯定時間，輕輕拿開物體，輕輕拿出EP管。

b.盡快將核酸粘稠物煮化，縮短提取蛋白時間。具體技巧與方法：

加熱前適度渦旋，加熱過程中用剪去尖端的槍頭吹打樣品。

c.提取的蛋白樣品置于?20℃保存。

⑶細胞刮法（針對貼壁細胞）

a.倒掉培育基，PBS洗培育皿2次。

b.吸盡殘留的PBS,參加預加了PMSF的SDS裂解液50-500U1,快速

用細胞刮將細胞刮下，并將裂解后的細胞轉(zhuǎn)移到EP管中，其他步驟

同SDS煮沸法。

留意事項：整個過程盡量在冰上操作以減慢蛋白的降解。

2.2蛋白樣品的定量

本試驗室承受BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，具體步驟:

a.將各蛋白樣品稀釋20倍（依據(jù)自己蛋白樣品的濃度可加大稀釋倍

數(shù)）至總體積為40ul或以上，以供每個樣品3個復孔。

b.將蛋白樣品和蛋白標準品參加96孔板中，每孔10ul,每個樣品3

個復孔。

c.配制顯色液，充分混勻，參加96孔板，每孔lOOulo

d.37℃孵育30min,酶標儀檢測吸光度。

留意事項：

a.盡量將樣品加在96孔板的中間位置，避開酶標儀檢測時的邊緣效

應。

b.參加樣品和顯色液的過程中盡量避開氣泡的產(chǎn)生。

c.選用準確度高的移液槍，盡量使用進口的槍頭。

2.3SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制

2.3.1不同濃度膠的最正確分別范圍

SDS-分別膠濃度最正確分別范

6類膠50-150kD

8用膠30-90kD

10%膠20-80kD

|12%膠

12-60kD

15%膠10-40kD

2.3.2不同濃度膠的配制

成分配制不同體積SDS-分別股所需各成分的體積（若升）

_________6%膠5ml10ml15ml201nl30ml50nli

蒸藤水2.04.06.08.012.020.0

30%Acr-Bis(29:l)1.02.03.04.06.010.0

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%過硫酸鉉0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04

成分配制不同體積SDS-分別膠所需各成分的體積（圣升）

8%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸飽水1.73.356.710.016.7

30%Aci-Bis(29:l)1.32.74.05.38.013.3

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%過硫酸鉞0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03

成分配制不同體枳SDS-分別股所需各成分的體積（毫升）

10%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸徽水1.32.74.05.38.013.3

30%Acr-Bis(29:l)1.73.35.06.710.016.7

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%過疏酸鉞0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

成分配制不同體積SDS-分別股所需各成分的體積（亮升）

12%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸懦水1.02.03.04.06.010.0

30%Acr-Bis(29:l)2.04.06.08.012.020.0

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%過硫酸鐐0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

成分配制不同體積SDS-分別股所需各成分的體積（宅升）

15%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸馀水0.51.01.52.03.05.0

30%Acr-Bis(29:l)2.55.07.510.015.025.0

IMTris,pll8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%過硫酸核0.05|0.1|0.150.2I0.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

依據(jù)如下表格配制SDS-的濃縮膠(也稱為積存膠、上層

膠)

成分配制不同體積SDS-濃縮股所需各成分的體積（定升）

8|10|

5%股2346

5.5|

蒸飾水1.42.12.74.16.8

30%Acr-Bis(29:l)0.330.50.671.01.31.7

IMTris,pH6.80.250.380.5|0.751.01.25

10%SDS0.020.030.040.060.080.1

10%過硫酸筱0.020.030.040.060.080.1

TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01

2.4WesternBlot主要步驟

（1）樣品制備（具體方法參見2.1.2）

進展Western雜交時還需設置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin和

GAPDHo

留意事項：一般上樣20?30pg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，

可加大上樣量至lOOgg,但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份濃縮

目的蛋白或承受更敏感的檢測方法。

（2）電泳分別（參照SDS-電泳方法）

留意事項：

a.膠版都是周密的玻璃器材，使用時輕拿輕放，制止將膠板放到烘

箱烘烤。

b.電泳槽和膠槽中的電泳液要充分，可以避開跑出“笑臉”和“哭

臉'。

C.依據(jù)試驗者的樣品數(shù)選擇相應的泳道數(shù)，樣品的兩側需參加蛋白

marker,便于剪切目的蛋白條帶。剩余的泳道參加等體積的1XSDS

填充，以平衡鹽離子電壓，這樣可以防止蛋白條帶跑歪。兩側的蛋白

marker可選擇不同的用量，然后依據(jù)蛋白marker的深和淺區(qū)分點樣

的挨次。

d.WesternBlot中使用過的任何器材、試劑、儀器，全部要放歸原位

或恢復到使用前的狀態(tài)。

（3）轉(zhuǎn)膜

雜交膜的選擇是打算Westernblot成敗的重要環(huán)節(jié)°應依據(jù)雜交

方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇適宜材質(zhì)、孔徑

和規(guī)格的雜交膜。用于Westernblot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜

（NC）和PVDF膜（基地目前使用）。NC膜是蛋白印跡試驗的標準固

相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會

與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑

作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。依據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大

小，選擇不同孔徑的NC膜。由于隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分

子量蛋白的結合就越結實。通常用0.45摩和0.2即兩種規(guī)格的NC

膜。大于20kD的蛋白可用0.45pm的膜，小于20kD的蛋白就要用

0.2|im的膜了，如用0.45|xm的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。

PVDF膜靈敏度、區(qū)分率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，格外適合于

低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需分別用純甲醇、純

水、轉(zhuǎn)膜液浸泡飽和5mino

蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)（基地目前使用）

和半干轉(zhuǎn)移。前者操作簡潔，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白

轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。

操作步驟：

a.將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10mino如檢測小分子蛋白，可省略此

步，因小分子蛋白簡潔集中出膠。

b.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡lOmino

c.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿+3層濾紙+膠+膜+3層濾紙+海綿，每層放

好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。

d,將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩

沖液，插上電極，選擇穩(wěn)流200mA,l-2h（依據(jù)分子量的大小打算電

泳時間）。留意：應再次檢查“三明治”和電極是否裝配正確，電源

是否接通。

e.轉(zhuǎn)膜完畢后，切斷電源，取出雜交膜

留意事項：

a.PVDF膜是比較貴重的試驗用品，使用時要節(jié)約使用，依據(jù)膠的大

小來裁剪PVDF膜。

b.做“三明治”的過程中，膜與膠之間不能有氣泡。

c.活化PVDF膜要充分，假設消滅點點白斑，說明活化不充分，需

要延長活化時間。

d,轉(zhuǎn)膜液可回收4次使用，回收次數(shù)過多影響試驗結果。

e.分子量大的蛋白需延長轉(zhuǎn)膜時間，小分子量蛋白則可適當增加轉(zhuǎn)

膜液中甲醇的比例。

f.轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜與膠接觸的一面標記為正面。

（4）免疫雜交與顯色

a.用25mlTBS洗膜5min,室溫，搖動。

b.置膜于25ml封閉緩沖液中l(wèi)h,室溫，搖動。

c.15mlTBS/T洗3次（5min/T）。

d.參加適宜稀釋度的一抗，室溫孵育l-2h（一抗無法回收）或4℃

過夜（一抗可回收屢次），緩慢搖動。

留意事項：

a.一抗為貴重的試驗用品，使用前必讀：本試驗室有比較齊全和充

分的抗體庫，全部（或大局部）購置的抗體在基地OA系統(tǒng)中均有具

體資料記錄，首先試驗者需要在OA系統(tǒng)中確定基地購置了目的蛋白

相關的抗體，然后確定所購置的抗體的生產(chǎn)商以及貨號，再依據(jù)這些

信息登陸相應生產(chǎn)商的網(wǎng)頁，具體查閱試驗者馬上使用一抗的用途

（VCB、IP、Flow、IF等）、一抗來源（便于選擇適宜的二抗）、目的

條帶的分子量大小（便于依據(jù)蛋白marker剪切目的條帶）、一抗的特

異性、一抗使用的稀釋比例。把握這些資料前方能開頭下一步的試驗。

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