綜合PCR的基因工程問題-2025年高考生物一輪復習資料

專題突破10綜合PCR的基因工程問題

闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過程與原理，舉例說明不同

課標要求

的PCR技術有著不同的應用。

2023?江蘇-T222023?山東-T252022?江蘇-T242022?山東-T25

幾種不同

考情分析2021.全國甲-T382021.山東-T252020-北京-T122020-江

PCR的應用

蘇133

類型一利用PCR技術獲取目的基因

【基本模型

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性

地快速擴增目的基因。PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原

理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核甘酸序列進行大量

復制的技術。該技術由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化

學獎。

典例突破

1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應的片段，若要用PCR技術特異性地拷貝“X

基因”，需在PCR反應中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結合位置如圖1所示。下

列敘述錯誤的是（）

A.第一輪復制得到2個DNA分子，即①②各一個

B.第二輪復制得到4個DNA分子，即①②③④各一個

C.第四輪復制得到16個DNA分子，其中有4個X基因

D.經五輪循環(huán)后產物中有五種不同的DNA分子

答案C

解析據圖分析可知，第一輪復制形成2個DNA分子，即①②各一個，A正確；第二輪復

制得到22=4（個）DNA分子，即①復制得①和③、②復制得②和④，即得到①②③④各一個，

B正確；第四輪復制得到16個DNA分子，其中有8個⑤（X基因），C錯誤；經五輪循環(huán)后

共形成32個DNA分子，其中①②各一個，③④各四個，22個⑤，故產物中有五種不同的

DNA分子，D正確。

類型二利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式

【基本模型

檢測目的基因在受體細胞內是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標

記基因、PCR技術和核酸分子雜交技術等方法鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因。在實際

操作中，PCR技術不僅可以精準地鑒定受體細胞是否轉入目的基因，還可以通過引物的巧妙

設計鑒定目的基因的連接方式。

典例突破

2.（2019?江蘇，33節(jié)選）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬

設計引物進行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR

鑒定時應選擇的一對引物是。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中

擴增出了400bp片段，原因是o

答案乙、丙目的基因反向連接

解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲

和丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴增的片段都是50+300+100=450（bp）,不

符合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結果不同，所以應選擇乙

和丙這對引物進行PCR鑒定。如果目的基因和質粒反向連接，則引物乙會出現(xiàn)在重組質粒的

外側，此時若加入引物甲和乙，則可以擴增出300+100=400（bp）的片段。

類型三利用PCR技術引導基因定點突變

【基本模型

重疊延伸PCR技術是指在PCR技術的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成

了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術。該技術在基

因的定點突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有著獨特的應用。

典例突破

3.水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水

蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）

替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG）,從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。

注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點。

（1）由以上事例可知，要對蛋白質的結構進行改造，需要通過來完成。

（2）若擬突變位點的堿基對為A-T,則需要讓其突變?yōu)椴拍苓_到目的。引物2

的突變位點（突起處）應設計為（假設引物為單鏈DNA）?

（3）在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應系統(tǒng)和引

物3、引物4組成的反應系統(tǒng)中均進行一次復制，共產生一種DNA分子。該階段必須將引

物1、2和引物3、4置于不同反應系統(tǒng)中，這是因為.

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

（4）利用重疊延伸PCR技術還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術

把基因M和N拼接在一起，設計基因M的引物Mj、M2，基因N的引物N］、N2?在設計這

4種引物時，特別要注意的問題是________________________________________________

答案（1）改造基因（或基因定點突變）（2）T—A或C—GA或G（3）3引物2和3中存在

互補配對片段，置于同一反應系統(tǒng)時會結合而失去作用

（4）MpM2中的一種引物與Nj、N2中的一種引物必須具有互補配對的片段

解析（2）若擬突變位點的堿基對為A—T,則需要讓其突變?yōu)門—A或C—G,對應的密碼子

由AAU變成AAA或由AAC變成AAG,可使天冬酰胺替換為賴氨酸。（3）若兩個反應系統(tǒng)

均進行一次復制，則會產生3種不同的DNA分子，因為引物1和4產生的DNA分子是一

樣的。（4）重疊互補引物的設計是重疊延伸PCR技術成功的關鍵。拼接基因M和N時，設計

引物時需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即MrM2中的一種引物與N「N2

中的一種引物必須具有互補配對的片段。

類型四利用PCR技術擴增未知基因序列

【基本模型

利用PCR技術進行基因擴增時，為了便于設計引物，要求目的基因兩側的序列是已知的。當

DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。

典例突破

4.（2020?江蘇，33節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側的序列，具體流程如圖（以EcoRI酶切為例）：

請據圖回答問題：

（1）步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切

割特定位點。

⑵步驟H用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3,一羥基與5'—磷酸間形成

;PCR循環(huán)中，升溫至U95℃是為了獲得;TaqDNA聚合酶

的作用是催化

（3）若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟III選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核甘酸序列）

^AACTATGCGCTCATGA----GCAATGCGTAGCCTCT-3,

已知序列1111?1111?111I1111111I1I?111?111

：V-TTGATACGCGAGTACT-...CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'—AACTATGCGCTCATGA—3'

②5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'

PCR引物

@5Z-AGAGGCTACGCATTGC-3'

@5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

答案（1）限制性內切核酸（或限制）核甘酸序列

（2）磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸（3）②④

解析（3）PCR過程中，根據已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是

相反的，引物的核甘酸序列要能夠和相應模板的核昔酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA

圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知

DNA序列的第一條鏈的左端互補結合，向右側方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物

是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合，向左側方向延伸形成子鏈，該引物是②。

類型五利用PCR技術快速檢測病原體

基本模型

病原體檢測是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準確地確定病原體的存在和種類，發(fā)

展了許多快速檢測方法。PCR技術是一種基于DNA擴增原理的快速病原體檢測方法，它能

夠在幾小時內擴增和檢測極小量的病原體DNA,并且具備高度的特異性和敏感性。

典例突破

5.猴痘是由猴痘病毒（一種RNA病毒）感染所致的一種病毒性人畜共患病，臨床上表現(xiàn)為發(fā)

熱、皮疹、淋巴結腫大等。猴痘病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。

（1）首先，從樣本中提取病毒RNA,經酶作用生成cDNA；然后以cDNA為模板進行

實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。

（2）通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針（一小段單鏈DNA,可與目的

基因中部序列特異性結合）。當探針完整時，不產生熒光。在PCR過程中，與目的基因結合

的探針被物DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測到（如圖1）。

姊

11111111J11111111111111111111”1

ra'i""

①當樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因復性時，通過原則而特

異性結合。

②在PCR循環(huán)的延伸階段，ThqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強

度與反應體系中DNA分子數呈_________（填“正相關”或“反相關”）關系。

（3）通過實時熒光PCR檢測猴痘病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。

①與指數增長期相比，線性增長期目的基因數量的增長率下降，原因可能有

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應管內的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經

歷的擴增循環(huán)數。因此，當樣本中初始模板越多時，Ct值就。

③某新猴痘病毒核酸檢測說明書標明，CtW37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖

2所示猴痘病毒核酸檢測結果應判定為。

（4）（多選）陰性結果也不能排除猴痘病毒感染，可能產生假陰性的因素有o

a.取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值

b.樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解

c.病毒發(fā)生變異

答案（1）逆轉錄（2）①堿基互補配對②正相關（3）①ThqDNA聚合酶活性下降、引物濃

度下降、原料dNTP濃度下降②越?、坳栃裕?）abc

解析（1）由病毒RNA生成cDNA的過程屬于逆轉錄，需要逆轉錄酶的催化。（2）①當樣本中

有目的基因時，引物和探針與目的基因復性時，通過堿基互補配對形成氫鍵而特異性結合。

②在PCR循環(huán)的延伸階段，物DNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。根據題干信息“熒

光信號的累積與PCR產物數量完全同步”可知，檢測到的熒光強度與反應體系中DNA分子

數呈正相關關系。（3）①與指數增長期相比，線性增長期目的基因數量的增長率下降，有可能

是底物濃度降低導致的，也有可能是酶的活性緩慢下降導致的。②樣本中初始模板越多時，

達到設定的熒光閾值時所經歷的擴增循環(huán)數就越少，Ct值就越小。③Ct<37判定為陽性，

Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2中熒光閾值大概是36,猴痘病毒核酸檢測結果應判定為陽

性。（4）陰性結果也不能排除猴痘病毒感染，可能產生假陰性的因素有取樣太早，樣本中病毒

量少，達不到實驗時熒光PCR檢測閾值；樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，從而導致

樣本中病毒量少；病毒發(fā)生變異，檢測不出來，從而出現(xiàn)假陰性。

課時精練

一、選擇題：每小題給出的四個選項中只有一個符合題目要求。

1.利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如圖所示）。圖中引物為單

鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是（）

nniiiimwu.

[[復性

第一輪循用

A.用PCR方法擴增目的基因時不需知道基因的全部序列

B.設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連

C.復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物

D.第四輪循環(huán)產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16

答案D

解析復性的目的是使引物與模板DNA結合，故復性溫度過高可能導致引物與模板DNA不

能結合，因而使得PCR反應得不到任何擴增產物，C正確；第四輪循環(huán)共形成16個DNA分

子，產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16=7/8,D錯誤。

2.PCR引物的3'端為結合模板DNA的關鍵堿基，5'端無嚴格限制，可用于添加限制酶切

點等序列。下列敘述正確的是（）

A.PCR第5個循環(huán)，消耗了16對引物

B.脫氧核甘酸作為擴增的原料，會依次連接到引物的5,端

C.PCR反應體系中需要加入脫氧核甘酸、耐高溫的DNA聚合酶、Ca2+等

D.用圖中引物擴增至少4個循環(huán)后才能獲得兩端均添加限制酶切點的目的產物

答案A

解析進行PCR時，擴增是從引物的3,端延伸，因此脫氧核甘酸作為擴增的原料會依次連

接到引物的3'端，B錯誤；PCR反應體系中需要加入脫氧核甘酸、耐高溫的DNA聚合酶和

擴增緩沖液（含Mg2+）等物質，不需要加Ca2+，C錯誤；用圖中引物擴增至少3個循環(huán)后才

能獲得兩端均添加限制酶切點的目的產物，D錯誤。

3.（2024?威海高三模擬）重疊延伸PCR可實現(xiàn)定點基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代

表突變位點）。下列說法正確的是（）

通用引物FP1突變用物FP2

突變弓I物RPI通用引物RP2

第1對引物

的PCR產物

第2對引物

重要區(qū)域

的PCR產物

②］混合.變性.復性

3'------------^3,

③延伸

通用引物FP1

4

通用引物RP2

突變的柒因

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產物

C.過程②的產物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2

答案D

解析兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應系統(tǒng)進行，A錯誤；過程①至

少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產物，B錯誤；過程②獲得的產物不都可以完成延

伸過程，因為子鏈只能從引物的3,端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由

于模板中不含有通用引物，則產生16個突變基因共需要消耗16X2—2=30（個）通用引物，而

需要通用引物RP2的數量為30+2=15（個），D正確。

4.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列（圖中L、R）進行擴增的技術，其過程

如圖所示。下列相關敘述不正確的是（）

已知序列

?_RD_a

醐切位點前切位點

,①靜切c

環(huán)化并加入根據已

知序列合成的引物

已知序列已知序列

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割

B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術可檢測T—DNA整合到植物染色體DNA的位置

答案C

解析過程③即PCR擴增，PCR技術中DNA解旋是在高溫下實現(xiàn)的，不需要加入解旋酶,

C錯誤。

5.（2024.泰州高三聯(lián)考）IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免

疫缺陷（SCID）患兒的次格基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃?為研究該患兒發(fā)病機制，

研究人員應用大引物PCR定點誘變技術獲得突變基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）

引物

/KKB基因

5'

PCKT

3'5'

引物也以L

C.大引物a鏈

G.大引物b鏈

/KK。基因

6'3'

PCR

23,1-----

引物C?…大引物a鏈

大引物b鏈

SacI

二55，

5'

C

HindHI

注：定點語變獲得突變基因的過程,需要以下

3種引物：

引物A:5"—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—3（

、、突變堿基

引物B:51—TAAGCTTCGAACATCCTA—3f

用ndI口識別序列

引物C:5"—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3'

SacI識別序列。

A.PCJ中使用的引物有引物A、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b鏈

C.PC.過程需要擴增3輪才能獲得目標產物

D.PCR?過程中，為減少錯誤DNA片段的產生可適當升高復性溫度

答案C

解析在PCR］中，需要兩種引物，將來在切取IKK/3基因時，在基因的左側需要用限制酶

引力dill來切割，在基因的右側用限制酶SacI切割，因此在PCJ中結合到基因右端的引物

選擇引物C,從題圖中看，另一個引物應含有突變堿基C,所以選擇引物A,A正確；在PCR

2

中，有一個引物結合到了基因的左端，應含有限制酶H譏dill識別的序列，所以要用到引物3,

而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應該結合到基因的右端，且從5'端到3,端的

序列中開始部位應含有SacI識別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCR

1

過程主要是為了獲得大引物，則擴增2輪即可獲得目標產物，C錯誤；由于大引物較長，含

C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCRZ復性過程中應適當提高溫度，便于

引物與模板鏈的結合，D正確。

6.（2024?蘇州高三調研）熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其

原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的

DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增

一次，就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（熒光信號達到

設定閾值時所經歷的循環(huán)次數）。下列相關敘述錯誤的是（

熒光探斜

熒光定量PCR

A.PCR每個循環(huán)包括變性、復性（引物和模板結合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監(jiān)測的熒光強度與起始時反應管內樣本DNA的含量呈正相關

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數目越多，患者危險性更高

答案D

解析Ct值越小，說明所需循環(huán)的次數越少，被檢測樣本中病毒數目越多，D錯誤。

二、選擇題：每小題給出的四個選項中有一個或多個符合題目要求。

7.（2024?衡陽高三質檢）研究人員用圖1中質粒和圖2中含目的基因的片段構建重組質粒（圖

中標注了相關限制酶切割位點），將重組質粒導入大腸桿菌后進行篩選及PCR鑒定。下列敘

述正確的是（）

A.構建重組質粒的過程應選用由根HI和"“dHI兩種限制酶

B.使用DNA連接酶將酶切后的質粒和目的基因片段進行重組

C.能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存一定是含有重組質粒的大腸桿菌

D.利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時應選用引物甲和引物丙

答案BD

解析用限制酶BtmzHI切割會使質粒中的兩種標記基因都被破壞，宜選Be/I和7/i力dill兩

種限制酶切割，A錯誤；能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的也可能是含有普通質粒的大腸桿

菌，c錯誤。

8.（2024.南通高三調研）如圖是被農桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán),

并以此環(huán)為模板進行PCR,擴增出T—DNA插入位置兩側的未知序列，據此來確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關說法正確的是（）

未知序列引物①T-,DNA引物②未知序列

j匚/—I第

限制扇造引物③弓.④限而q偷切點

A.農桿菌在自然條件下主要侵染單子葉植物和裸子植物，T—DNA存在于其Ti質粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側的未知序列

C.若擴增循環(huán)〃次，需要2"+i—2個引物

D.將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—DNA的插入位置

答案CD

解析農桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染

能力，A錯誤；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3,端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④

組合可擴增出兩側的未知序列，B錯誤；擴增循環(huán)〃次，得到2“個DNA分子，總單鏈數為

2X2〃即2〃+i條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2h1—2個引物，C正確；

不同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確

定T—DNA的插入位置，D正確。

9.實時熒光定量RT—PCR技術需要在常規(guī)PCR基礎上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料

能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號。在流感流行季節(jié)，對懷疑流感病毒感染的

患者，可以通過實時熒光定量RT—PCR技術進行核酸檢測。下列相關敘述不正確的是（）

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標記的流感病毒獨特的基因序列

B.核酸檢測是通過檢測熒光信號來確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術利用了DNA雙鏈復制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT—PCR技術測定病毒的核酸具有特異性

答案C

解析PCR技術利用了DNA雙鏈復制的原理，不需要解旋酶，可通過高溫使DNA雙鏈解開，

但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯誤。

三、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術

構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：

擬構建的「二

基因結構:W\'二3注：EGFP黃光蛋白

爾日由AnB網樂抗獻

卜

■=也F2片段1PCR引物

TXrFI片段N—三三：■■-及日的產

.古物片段

Mm.丫□一|二線性則

基因也組;1T—七k-------------1j載體

克隆流程:

PCR產物片段與n版用解

線性載體混合0-

-注：一*表示PCR引物；

―轉化/相同背景方框表示

<=|J同源序列。

(1)分別進行PCR擴增片段Fl與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有

擴增程序中最主要的不同是

(2)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質粒，直接用于轉

化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有

(3)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30?300個菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高

C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化

(4)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板、用引物Fl—F和

F2—R進行了PCR擴增，質粒P1?P4的擴增產物電泳結果如圖2。根據圖中結果判斷，可

以舍棄的質粒有

圖2

⑸對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是

答案⑴模板、引物引物的設計（2）限制酶、（T4）DNA連接酶（3）ABC（4）P3、P4

（5）電泳只能檢測DNA分子的大小（長度），無法確定待檢測DNA分子的堿基序列

解析（l）PCR反應進行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。分別進

行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、

引物。PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結合。

引物設計是決定PCR反應成敗的最主要因素。（2）傳統(tǒng)重組質粒構建需要使用限制性內切核

酸酶（限制酶）切割質粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的

基因和質粒連接成重組質粒。將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在DNA連接酶的作

用下可形成環(huán)化質粒，不需要使用限制性內切核酸酶（限制酶）。（3）用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計

數時，為了使結果更準確，一般選擇菌落數為30?300的平板，A錯誤；培養(yǎng)基冷卻后才接

種，故抗性平板上未長出菌落不是因為培養(yǎng)基溫度太高，B錯誤；轉化后的大腸桿菌需采用

含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會出現(xiàn)大量

雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細菌的方法，用稀釋

涂布平板法接種后在抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化，D正確。（4）EGFP為720

bp,AnBl為390bp，二者的總大小為720+390=1100（bp）,用引物F1—F和F2—R進行PCR

擴增，其大小接近于Pl、P2,根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有P3、P4。（5）瓊脂糖凝

膠電泳技術僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列，

因此對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認。

11.基因工程在農業(yè)方面的應用發(fā)展迅速，我國轉基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請回答下列相關問題:

(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機會和可能，目的基因往往從相關的

_______________________的基因中進行篩選。

(2)目的基因可以人工合成、從基因文庫中獲取，還可以利用PCR技術獲取和擴增。如圖1

展示了PCR技術獲取和擴增目的基因的原理，請分析回答下列問題：

目的基因

一?引物2?瓶一盟

3，■引—5」分子

圖1

①PCR技術利用了DNA半保留復制原理和原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、

復性和延伸三個過程，復性的作用是。

②將一個DNA分子進行擴增，理論上目的基因最早在第次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)

后，可擴增得到個目的基因。

⑶反向PCR可用于擴增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內側是已知序列，

外側為未知序列。請回答相關問題：

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是,

EcoRI切割得到黏性末端的原因是o

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設計引物并進行擴增，原因是o

③圖4中環(huán)狀DNA進行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是(填“順時

針”或“逆時針”),PCR產物(填“含有”或“不含")EcoRI的酶切位點。

答案(1)已知結構和功能清晰(2)①堿基互補配對使引物通過堿基互補配對與兩條單鏈

結合②322(3)①兩個末端互補的堿基之間可以自發(fā)形成氫鍵切割位點在識別序列中

心軸線兩側②DNA兩端序列未知，無法設計引物③逆時針含有

12.乙烯受體是乙烯感受和轉導信號的初始元件，廣泛存在于各種植物中，并決定植物各種

組織對乙烯反應的敏感性。通過對多種植物研究表明，鈍化植物對外源乙烯的敏感性比抑制

內源乙烯的生物合成更為有效地延長植物的采后壽命。科學家從草莓中提取乙烯受體Ersl

基因，通過基因工程將Ersl基因反向連接在啟動子后，篩選轉入反義Ersl基因的草莓，達

到延長儲藏期的效果?；卮鹣铝袉栴}：

(1)草莓DNA的提取：取草莓植株葉片，置于預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉碎后，加入

400uLSDSDNA提取液繼續(xù)研磨，提取液中含有可防止DNA被水解。

待充分研磨后收集至離心管中，離心后?、儆诹硪桓蓛綦x心管中，加入200HL異丙醇，離心

10min之后棄去管中的②，加入80NL體積分數為70%的乙醇，離心5min之后?、郾４妗?/p>

過程中的①②③分別是(填“上清液”或“沉淀””

(2)通過上述方法獲得DNA后，需要通過PCR技術進行擴增ErsJ基因(如圖1)。為使目的基

因與質粒連接，在設計PCR引物擴增Ersl基因時需添加限制酶X/ioI的識別序列(5‘一

CTCGAG-3/)?已知Ersl基因左端①處的堿基序列為一TTCCAATTTTAA-,則其中一種

引物設計的序列是5'3,。在PCR體系中，加入的dNTP可

提供。PCR產物通過電泳進行分離后，可割下回收擴增的

Ersl基因。

0<imHI

①處IWObpXhoI湖律素抗

P-i----------------OH

HO-/一J-PH卜性基因

““基因（向700bp）n,ilK

轉錄方向啟動子終止子

6000bpRB

PCR產物

K那霉素

抗性基因

的切I連接注:LB.RB分別為T-61A

三種連接產物的左邊界、右邊界。

圖I

(3)經X/w1酶切后的載體和Ers/基因進行連接(如圖)，連接產物經篩選得到的載體主要有三

種：單個載體自連、Ersl基因與載體正向連接、Ers/基因與載體反向連接。為鑒定這3種連

接方式，選擇班aI酶和Ba〃汨I酶對篩選的載體進行雙酶切，并對酶切后的DNA片段進

行電泳分析，請在圖2中畫出電泳結果，需標明電泳片段DNA大致長度。

(4)用處理農桿菌，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，將篩

選得到的反向連接質粒與處理后農桿菌混合，使重組質粒進入農桿菌，完成實驗。

將農桿菌涂布接種于添加有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，目的是

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