洋蔥、大蒜病毒鑒定技術(shù)規(guī)程

1洋蔥、大蒜病毒鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了內(nèi)蒙古洋蔥、大蒜病毒鑒定技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義，檢測(cè)對(duì)象，取樣部位，抽樣，鑒定方法和判定規(guī)則。本文件適用于內(nèi)蒙古洋蔥、大蒜的病毒鑒定。環(huán)境相似的洋蔥、大蒜產(chǎn)區(qū)可參照?qǐng)?zhí)行。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1洋蔥Alliumcepa又稱蔥頭、圓蔥，百合科、蔥屬兩年生園藝作物，以地下鱗莖為食用部位，具有強(qiáng)烈香氣。3.2大蒜Alliumsativum百合科、蔥屬多年生園藝作物，繁殖殖方式為營(yíng)養(yǎng)繁殖。3.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)提取洋蔥、大蒜檢材的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。4檢測(cè)對(duì)象4.1洋蔥主要病毒a）洋蔥黃矮病毒（onionyellowdwarfvirus，OYDV）b）韭蔥黃條病毒（leekyellowstripevirus，LYSV）c）胡蔥黃條病毒（shallotyellowstripevirus，SYSV）d)大蒜普通潛隱病毒（garliccommonlatentvirus，GCLV）f)鳶尾黃斑病毒(irisyellowspottospovirus，IYSV)g)番茄斑萎病毒(tomatospottedwilttospovirus，TSWV)h)黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirus，CMV）4.2大蒜主要病毒a）洋蔥黃矮病毒（onionyellowdwarfvirus，OYDV）2b）韭蔥黃條病毒（leekyellowstripevirus，LYSV）c）胡蔥黃條病毒（shallotyellowstripevirus，SYSV）d)大蒜普通潛隱病毒（garliccommonlatentvirus，GCLV）e）蔥潛隱病毒（shallotlatentvirus，ShLV）f）鳶尾黃斑病毒(irisyellowspottospovirus，IYSV)g）番茄斑萎病毒(tomatospottedwilttospovirus，TSWV)h）大蒜黃花葉相關(guān)病毒(garlicyellowmosaic-associatedvirus，GYMaV）i）黃瓜花葉病毒（cucumbermosaicvirus，CMV）j）大蒜病毒A（garlicvirusA，GarV-A）k）大蒜病毒B（garlicvirusB，GarV-B）l）大蒜病毒C（garlicvirusC，GarV-C）m）大蒜病毒D（garlicvirusD，GarV-D）n）大蒜病毒E（garlicvirusE，GarV-E）o）大蒜病毒X（garlicvirusX，GarV-X）p）蔥病毒X(shallotvirusX，ShV-X)q）紫云英矮縮病毒（milkvetchdwarfvirus，MDV）5取樣5.1取樣方法5.1.1五點(diǎn)取樣法對(duì)于洋蔥、大蒜無(wú)癥狀的種植區(qū)或面積較大的種植區(qū)采用5點(diǎn)取樣法隨機(jī)抽取。1000株以內(nèi)抽檢10株（含1000株）；1000株～10000株（含10000株）,首個(gè)1000株抽檢10株之后每增加1000株增檢5株，不足1000株按1000株計(jì)；超過(guò)10000株，第1000～10000株按上述方法抽樣，之后每增加1000株增檢20株，不足1000株按1000株計(jì)。5.1.2根據(jù)癥狀觀測(cè)取樣感染病毒病的洋蔥、大蒜極易表現(xiàn)出矮化、扭曲、黃化、褪綠以及壞死斑等癥狀。根據(jù)在洋蔥、大蒜上觀測(cè)的各癥狀表現(xiàn)可進(jìn)行有效取樣。5.2取樣部位洋蔥、大蒜生長(zhǎng)前期取幼嫩葉片放置自封袋，4℃保存不超過(guò)24h或液氮預(yù)冷后立即放置于-80℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫簧L(zhǎng)后期以嬌嫩葉片及鱗莖為取樣部位，較嫩葉片放置自封袋，立即進(jìn)行液氮預(yù)冷并放置-80℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?，鱗莖放置干燥、通風(fēng)、無(wú)污染的收集盒中存放。6反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR法)鑒定詳見(jiàn)附錄A。7判定規(guī)則RT-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的判定為攜帶病毒。脫毒洋蔥、大蒜帶毒率為0。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR法)鑒定A.1試劑盒A.1.1植物DNA、RNA提取試劑盒：選擇適合提取含有多糖多酚材料的DNA、RNA試劑盒。B.1.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒：使用市售的商品反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明進(jìn)行操作。B.1.3PCR擴(kuò)增試劑盒：使用市售的商品PCR擴(kuò)增試劑盒，按照說(shuō)明進(jìn)行操作。A.2引物侵染洋蔥、大蒜的各病毒PCR檢測(cè)特異性引物見(jiàn)表A.1表A.1洋蔥、大蒜各病毒的特異性引物℃bpACTGAAATGCGCCATTATYT4CGGATCCTTAGAATGTTATAATACTAAGCCCCGCCCCAGCTCA.3操作步驟A.3.1洋蔥、大蒜各病毒DNA或RNA提取A.3.1.1提取方法按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取。A.3.1.2判定規(guī)則提取的RNA質(zhì)量判定參照DB6111/T172—2021執(zhí)行。DNA判定采用電泳法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)有1條清晰明亮的條帶；微量分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280比值1.8以上，以此為模板直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于-80℃條件下保存。不符合以上指標(biāo)的需重新提取。A.3.2反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。A.3.3病毒檢測(cè)A.3.3.1PCR擴(kuò)增A.3.3.1.1PCR的反應(yīng)體系5按說(shuō)明書(shū)指定的劑量在PCR反應(yīng)管中依次加入多聚酶,病毒特異性檢測(cè)上下游引物，cDNA模板或提取的樣本DNA,無(wú)菌蒸餾水。目標(biāo)病毒對(duì)應(yīng)檢測(cè)引物見(jiàn)表A.1。A.3.3.1.2PCR反應(yīng)程序?qū)CR管放入PCR儀中,按說(shuō)明書(shū)指定程序進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，待測(cè)病毒引物退火溫度按指定值進(jìn)行輸入，延伸時(shí)長(zhǎng)可根據(jù)片段大小適當(dāng)調(diào)整，反應(yīng)產(chǎn)物采用凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。A.3.3.2電泳檢測(cè)制備1%的瓊脂糖凝膠,每個(gè)泳道加入5μL的PCR產(chǎn)物，110V恒壓電泳25min。A.3.3.3凝膠成像分析電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增出的目的條帶大小是否符合目