T-LNSI 010-2024 人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體

ICS11.020CCSC05HumanamnioticmesenchymalstemcellderiIT/LNSI010-2024 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4符號和縮略語 5技術(shù)要求 6檢驗方法 7檢驗規(guī)則 8使用說明 9標簽 10包裝、儲存及運輸 11廢棄物處理 附錄A（規(guī)范性）外泌體形態(tài)檢測透射電鏡觀察法 9附錄B（規(guī)范性）外泌體數(shù)量檢測納米流式檢測法 10附錄C（規(guī)范性）外泌體粒徑檢測納米流式檢測法 12附錄D（規(guī)范性）外泌體蛋白檢測蛋白印跡法 14附錄E（規(guī)范性）抑制淋巴細胞增殖檢測CFSE標記法 附錄F（規(guī)范性）抑制Th1功能檢測胞內(nèi)因子染色法 17T/LNSI010-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化的文件結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點實驗室提出。本文件由遼寧省免疫學(xué)會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、中國醫(yī)科大學(xué)干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究室、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點實驗室、沈陽市干細胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室、遼寧艾米奧干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、遼寧省細胞生物學(xué)學(xué)會、遼寧省生物技術(shù)協(xié)會、沈陽市干細胞與再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽藥科大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國際干細胞醫(yī)院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風(fēng)平、王莉莎、赫甡、宋揚、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、蘇航、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航、王嬌。本標準的制訂基于相關(guān)技術(shù)的綜合考慮，旨在推動行業(yè)的發(fā)展和規(guī)范化。在編寫過程中，團體成員充分研究了現(xiàn)有技術(shù)和專利信息，并積極尋求相關(guān)權(quán)益方的支持和參與。特此聲明，在編寫本標準期間，我們已經(jīng)采取了合理的努力來促進并保護涉及的知識產(chǎn)權(quán)。鑒于技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，如果其他相關(guān)專利或權(quán)益未在本標準中明確聲明，請權(quán)益人及時聯(lián)系標準制定團體，以便進行進一步的溝通和許可。本標準中使用的專利聲明如下：[CN201010252201]：[中國醫(yī)科大學(xué)]，[CN]，[一種人羊膜間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法]。以上聲明是為了更好地保護知識產(chǎn)權(quán)，遵循了國家相關(guān)法律法規(guī)和知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定。我們鼓勵所有使用本標準的相關(guān)方與專利權(quán)人合作，以確保公平的利益分配和技術(shù)發(fā)展。1T/LNSI010-2024人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體本文件規(guī)定了人羊膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體的技術(shù)要求、檢驗方法、檢驗規(guī)則、使用說明、標簽、包裝、儲存、運輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人羊膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體的生產(chǎn)和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS273梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》T/LNSI001-2023《人羊膜間充質(zhì)干細胞》T/CSCB0007-2022《人干細胞來源細胞外囊泡制備通用要求》T/CSCB0001-2022《人干細胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范》GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗操作規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1干細胞stemcells2T/LNSI010-2024干細胞是來自于胚胎、胎兒或成人體內(nèi)具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細胞，能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同的子細胞，也能產(chǎn)生組成機體組織、器官的已特化的細胞，同時還能分化為祖細胞。3.2間充質(zhì)干細胞mesenchymalstemcells間充質(zhì)干細胞是一種多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。3.3人羊膜間充質(zhì)干細胞humanamnioticmesenchymalstemcells人羊膜間充質(zhì)干細胞屬中胚層來源，是一種存在于人羊膜間充質(zhì)的多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。3.4外泌體exosome外泌體是細胞分泌的膜外雙層脂質(zhì)小囊泡，直徑30~200nm，包含了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及RNA等物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)運核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，參與細胞間的信息交流。3.5人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體humanamnioticmesenchymalstemcellderivedexosome人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體是人羊膜間充質(zhì)干細胞分泌的膜外雙層脂質(zhì)小囊泡，粒徑應(yīng)小于200納米，呈雙層膜結(jié)構(gòu)的茶托狀結(jié)構(gòu)。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型病毒性肝炎（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV——人類嗜T細胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）3T/LNSI010-20245技術(shù)要求5.1原材料5.1.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。5.1.2應(yīng)建立供者細胞采集的供者評估與篩選標準、采集方法、運輸標準和交接標準，保證供者和細胞的安全。5.1.3供體應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結(jié)果。5.2制備與純化方法5.2.1人羊膜間充質(zhì)干細胞人羊膜間充質(zhì)干細胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性應(yīng)符合T/LNSI001-2023的規(guī)定。5.2.2人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清為了獲得高質(zhì)量的外泌體，收獲外泌體最佳時間限定為P2-P3代人羊膜間充質(zhì)干細胞，要求融合率達95%以上的細胞上清。5.2.3外泌體的制備與純化應(yīng)符合T/CSCB0007-2022的要求。5.3關(guān)鍵質(zhì)量屬性5.3.1形態(tài)透射電顯微鏡觀察，外泌體形態(tài)為雙層膜結(jié)構(gòu)的茶托狀結(jié)構(gòu)。5.3.2粒徑外泌體粒徑應(yīng)小于200nm，且在60-120nm范圍內(nèi)形成粒徑峰值。5.3.3濃度用于皮膚及骨關(guān)節(jié)抗衰用人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體濃度應(yīng)不低于3×1010顆粒/ml。5.3.4標志蛋白外泌體表面標志物CD63、CD81和CD9中的任意兩個表達陽性。4T/LNSI010-20245.3.5微生物真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。5.3.6過程控制人羊膜間充質(zhì)干細胞制備過程控制應(yīng)符合T/LNSI001-2023要求。外泌體分離過程控制應(yīng)符合T/CSCB0007-2022的要求。6檢驗方法6.1人羊膜間充質(zhì)干細胞按照“T/LNSI001-2023”文件規(guī)定的關(guān)鍵質(zhì)量屬性標準進行檢驗。6.2形態(tài)按照附錄A的方法檢驗。6.3粒徑按照附錄B的方法檢驗。6.4數(shù)量按照附錄C的方法檢驗。6.5表面標志蛋白按照附錄D的方法檢驗。6.6免疫調(diào)節(jié)6.6.1抑制淋巴細胞增殖按照附錄E的方法檢驗。6.6.2抑制Th1細胞功能按照附錄F的方法檢驗。6.7微生物5T/LNSI010-20246.7.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢驗。6.7.2細菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢驗。6.7.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項檢驗。6.7.4HBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.5.5HCV按照WS213核酸法檢驗。6.7.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗。6.7.7HTLV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.8EBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.9HCMV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。6.7.10TP按照WS273核酸法檢驗。6.7.11外源病毒因子按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3302外源病毒因子檢查法”項檢驗。6T/LNSI010-20247檢驗規(guī)則7.1抽樣方法和數(shù)量7.1.1在一個生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。7.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機抽取3個最小包裝單元。7.2出廠檢驗7.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進行出廠檢驗，并附檢驗報告。7.2.2出廠檢驗項目應(yīng)包括5.3規(guī)定的所有項目。7.3復(fù)核檢驗若客戶需要，應(yīng)由第三方專業(yè)細胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M行復(fù)核檢驗，檢驗項目應(yīng)包括第5章規(guī)定的所有項目。7.4判定規(guī)則7.4.1出廠檢驗項目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。7.4.2復(fù)核檢驗項目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。8使用說明應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：a）外泌體來源細胞名稱；b）外泌體來源細胞代次；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；7T/LNSI010-2024i）使用方法；j）執(zhí)行標準號；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；m）郵政編碼；n）注意事項。注：根據(jù)用戶需求，可標注內(nèi)毒素含量。9標簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：a）外泌體來源細胞名稱；b）外泌體來源細胞代次；c）外泌體的濃度；d）生產(chǎn)日期；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；g）儲存條件。10包裝、儲存及運輸10.1包裝應(yīng)選擇對人羊膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的袋或瓶中，應(yīng)選擇低吸附性的袋或瓶。10.2儲存應(yīng)在低于-80℃環(huán)境下儲存。10.3運輸凍存的外泌體應(yīng)在干冰或低于-80℃條件下運輸，非凍存的外泌體應(yīng)在2℃~8℃條件下運輸。8T/LNSI010-202411廢棄物處理人羊膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體生產(chǎn)和檢測過程中生產(chǎn)的廢棄物應(yīng)按照T/CSCB0001-2022中的規(guī)定處理。9T/LNSI010-2024（規(guī)范性）外泌體形態(tài)檢測透射電鏡觀察法A.1儀器和設(shè)備A.1.1透射電子顯微鏡。A.1.2載樣銅網(wǎng)。A.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2戊二醛溶液。A.2.3醋酸雙氧鈾溶液。A.3檢測步驟A.3.1將外泌體樣品滴加于載樣銅網(wǎng)上，靜置20min。A.3.2滴加適量磷酸緩沖液于樣本上，清洗3次。A.3.3滴加適量戊二醛溶液于樣本上，固定5min，隨后用超純水清洗8次。A.3.4用醋酸雙氧鈾溶液染色5min。A.3.5銅網(wǎng)在常溫下干燥10min。A.3.6將銅網(wǎng)置于透射電子顯微鏡樣本室內(nèi)，觀察外泌體形態(tài)。A.4結(jié)果分析透射電鏡顯微鏡下可觀察到100nm左右外泌體膜的茶托樣結(jié)構(gòu)。T/LNSI010-2024（規(guī)范性）外泌體數(shù)量檢測納米流式檢測法B.1儀器和設(shè)備B.1.1納米流式儀。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。B.2.2納米流式濃度標準品（1.99×1010個顆粒/mL）。B.3檢測步驟B.3.1按照使用說明，對納米流式儀進行液流初始化和管路氣泡排出。B.3.2用超純水將濃度標準品稀釋10倍，按照使用說明進行納米流式儀的質(zhì)控，將納米流式儀調(diào)試到最佳檢測狀態(tài)后（散射和熒光通道的信號均達到最強且均一在濃度標準品的測量參數(shù)下對稀釋后的標準品采集數(shù)據(jù)。B.3.3按照使用說明，依次用洗液和超純水清洗進樣毛細管。B.3.4在LabelledExo樣品測量參數(shù)下檢測磷酸鹽緩沖液的顆粒數(shù)，確定磷酸緩沖液的潔凈度，顆粒數(shù)計數(shù)小于200的磷酸鹽緩沖液才能作為空白對照的數(shù)據(jù)采集并用于后續(xù)的樣品稀釋。如果顆粒數(shù)計數(shù)高于200，需用0.22um的過濾膜過濾。B.3.5用潔凈的磷酸鹽緩沖液將外泌體樣品預(yù)稀釋100倍，在EXO樣品測量參數(shù)對外泌體樣本進行數(shù)據(jù)采集。納米流式儀顆粒計數(shù)在4000-8000之間為準確測量范圍，若樣品顆粒數(shù)計數(shù)過高或過低，則需調(diào)整樣品的稀釋倍數(shù)，在進行測定，記下樣品的最終稀釋倍數(shù)。另外需注意樣品上機檢測時散射通道的基線和自動閾值與空白對照（磷酸緩沖液）檢測的基線和自動閾值是否一致，若樣品檢測時出現(xiàn)基線抬升，則需重新制備更高純度的樣品。B.4結(jié)果分析T/LNSI010-2024得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算外泌體數(shù)量。抑制率按式（B.1）進行計算：X=(B-C)/A×1.99×108×D×E（B.1）式中：Y—外泌體樣本的數(shù)量；A—測得的標準品顆粒數(shù)；B—測得的（稀釋后）樣本顆粒數(shù)；C—空白對照的顆粒。D—樣本的稀釋倍數(shù)；E—樣本的體積（mL）。T/LNSI010-2024（規(guī)范性）外泌體粒徑檢測納米流式檢測法C.1儀器和設(shè)備C.1.1納米流式儀。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。C.2.2納米流式濃度標準品（1.99×1010個顆粒/mL）。C.2.3S16M-EXO粒徑標準品。C.3檢測步驟C.3.1按照使用說明，對納米流式儀進行液流初始化和管路氣泡排出。C.3.2用超純水將濃度標準品稀釋10倍，按照使用說明進行納米流式儀的質(zhì)控，將納米流式儀調(diào)試到最佳檢測狀態(tài)后（散射和熒光通道的信號均達到最強且均一在濃度標準品的測量參數(shù)下對稀釋后的標準品采集數(shù)據(jù)。C.3.3按照使用說明，依次用洗液和超純水清洗進樣毛細管。C.3.4在LabelledExo樣品測量參數(shù)下檢測磷酸鹽緩沖液的顆粒數(shù)，確定磷酸緩沖液的潔凈度，顆粒數(shù)計數(shù)小于200的磷酸鹽緩沖液才能作為空白對照的數(shù)據(jù)采集并用于后續(xù)的樣品稀釋。如果顆粒數(shù)計數(shù)高于200，需用0.22um的過濾膜過濾。C.3.5用潔凈的磷酸鹽緩沖液將外泌體樣品預(yù)稀釋100倍，在EXO樣品測量參數(shù)對外泌體樣本進行數(shù)據(jù)采集。納米流式儀顆粒計數(shù)在4000-8000之間為準確測量范圍，若樣品顆粒數(shù)計數(shù)過高或過低，則需調(diào)整樣品的稀釋倍數(shù)，在進行測定，記下樣品的最終稀釋倍數(shù)。另外需注意樣品上機檢測時散射通道的基線和自動閾值與空白對照（磷酸緩沖液）檢測的基線和自動閾值是否一致，若樣品檢測時出現(xiàn)基線抬升，則需重新制備更高純度的樣品。T/LNSI010-2024C.4結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明，最終得到待測樣品粒徑檢測報告。T/LNSI010-2024（規(guī)范性）外泌體蛋白檢測蛋白印跡法D.1儀器和設(shè)備D.1.1電泳儀。D.1.2轉(zhuǎn)膜儀。D.1.3搖床。D.1.4化學(xué)熒光成像儀。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。D.2.2商品化分離膠、濃縮膠溶液。D.2.3TBST平衡鹽緩沖液。D.2.4電泳緩沖液。D.2.5轉(zhuǎn)膜緩沖液。D.2.6封閉液。D.2.7抗體（一抗、二抗）。D.3檢測步驟D.3.1SDS電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。D.3.1.1取20um外泌體（濃度不低于1×1010個顆粒/mL）使用電泳儀和垂直電泳槽進行電泳。按照儀器說明書進行。D.3.1.2使用轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜。按照儀器說明書進行。D.3.1.3轉(zhuǎn)膜后，使用封閉液室溫封閉1h。D.3.2抗體孵育T/LNSI010-2024D.3.1.1孵育一抗，搖床4℃過夜。孵育結(jié)束后，用TBST平衡鹽緩沖洗滌3次。D.3.1.2孵育二抗，搖床室溫封閉1h。孵育結(jié)束后，用TBST平衡鹽緩沖洗滌3次。D.3.3顯影使用化學(xué)熒光成像系統(tǒng)進行顯影。按照儀器說明書進行。T/LNSI010-2024（規(guī)范性）抑制淋巴細胞增殖檢測CFSE標記法E.1儀器和設(shè)備E.1.1血球計數(shù)板。E.1.2倒置顯微鏡。E.1.3水平離心機。E.1.4流式細胞儀。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。E.2.1磷酸緩沖液：pH為7.4。E.2.4植物凝集素（PHA）。E.2.5淋巴細胞分離液。E.2.7羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）染料。E.3檢測步驟E.3.1利用淋巴細胞分離液，分離外周血單核細胞（PBMC）。E.3.2使用血球計數(shù)板及顯微鏡計算細胞懸液活細胞濃度。然后進行CFSE標記，根據(jù)CFSE產(chǎn)品說明書進行。E.3.3使用血球計數(shù)板及顯微鏡計算CFSE標記細胞濃度，將PBMC以5×105細胞/mL接種于12孔培養(yǎng)板中，反應(yīng)體系1m