DB34∕T 2996-2017 豬鏈球菌檢驗(yàn)操作規(guī)程　

DB34DB34/T2996—2017豬鏈球菌檢驗(yàn)操作規(guī)程ProtocolofexaminationforStreptococcussuis安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培SN/T2984檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)3.4冰箱：2℃~10℃。）：24檢驗(yàn)程序豬鏈球菌檢驗(yàn)程序見圖1。檢樣檢樣顯微鏡檢查PCR血清型鑒定結(jié)果報(bào)告分離培養(yǎng)動(dòng)物試驗(yàn)生化反應(yīng)5.1.3樣品均需采取低溫(4～8℃)保存和運(yùn)輸常與細(xì)菌的種類及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，固體培養(yǎng)物以雙球菌為多，少量呈3個(gè)～5個(gè)排列的短鏈，液體培劃線接種于血液瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,如菌落生長(zhǎng)緩慢，可延長(zhǎng)至48h±2h,使之形成單個(gè)菌落，以供鑒定用。3用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)蘸取病料內(nèi)部組織后劃線接種于血液瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，如菌落生長(zhǎng)緩慢，可延長(zhǎng)至48h±2h后觀察。同時(shí)取病料做組織觸片，姬姆薩染色后鏡5.3.5在血液瓊脂平板和選擇性普通瓊5.5.2小鼠模型：將肺、腦、脾、肝、淋巴結(jié)磨碎，用滅菌生理鹽水制成1:5組的肉湯純培養(yǎng)物用于動(dòng)物試驗(yàn)。小鼠皮下注射組織懸液0.2m4個(gè)血清型。大多數(shù)致病性菌株為1～9血清型，其中豬鏈球菌2型為最常見和5培養(yǎng)基的配制將38～39g氯化鈉加入100mL蒸餾水中，充將A.3.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解6將A.4.1中THB培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱溶解，127PCR擴(kuò)增儀、1.5mL離心管、0.2mLPCR反應(yīng)管、水浴鍋、高2×PCRMasterMix、滅菌超純水、瓊脂糖、10mg/ML溴化乙錠（EB（10×LoadingBuffer）、相對(duì)分子質(zhì)量MagdhGCAGCGTATTCTGTCAAACGCCATGGACAGATAAcps1IGGAATAAAGCGGAGTACAGCGTCCTGCACGGTATTcps2JCAAACGCAAGGAATTACGGTATCGAGTATCTAAAGAATGcps7HGGAAAGAGACACGTTGGTATCGGACACGTAAAGACTcps9HGGCTACATATAATGGAAGCCCCCGAAGTATCTGGG8DB34/T29檢測(cè)過(guò)程應(yīng)同時(shí)做陽(yáng)性和陰性空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照模板為豬1、2、7、9型鏈球菌，陰性空白對(duì)照表B.2PCR反應(yīng)條件檢測(cè)基因溫度/時(shí)間溫度/時(shí)間溫度/時(shí)間延伸溫度/時(shí)間數(shù)延伸溫度/時(shí)間575555流100A,電泳30min。用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄電泳結(jié)果。豬鏈球菌的目的基因大小為688bp,1、2、7、9型目的基因大小分別為陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出目的基因條帶的大小，陰性空白對(duì)照孔未見有PCR擴(kuò)增條帶，表明試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重做。試驗(yàn)成立，被檢樣品孔如發(fā)現(xiàn)有688、210、675、395、390bp大小的擴(kuò)增條帶，則判定陽(yáng)性(十),豬鏈球菌及1、2、7、9型PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖見圖B.1、圖B.2、圖B.3、圖B.4、圖B.5;被檢樣品孔如未發(fā)現(xiàn)有目的條帶大小的擴(kuò)增條帶，則判為陰性(一)。9