高中生物拓展課件：原生質(zhì)體的分離 高二上學(xué)期

原生質(zhì)體的分離，融合，培養(yǎng)及復(fù)壁

給我一個活的細(xì)胞，我可以創(chuàng)造一個生物世界！

FrancoisVincent,Raspail

新生嬰兒的細(xì)胞數(shù)目約為1012個；成年人的細(xì)胞數(shù)目約為2×1014個，約200種細(xì)胞。給出一個不是定義的定義---什么是細(xì)胞？

一切生命的關(guān)鍵問題都要到細(xì)胞中去尋找！Wilson

1.一切植物和動物都是由細(xì)胞組成－－施旺和施萊登

2.細(xì)胞是生命活動完整實施的基本單位。

上述兩項分別說明了生命個體與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系細(xì)胞

細(xì)胞是多層次非線性的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系

細(xì)胞具有高度復(fù)雜性和組織性

細(xì)胞是物質(zhì)（結(jié)構(gòu)）、能量與信息過程精巧結(jié)合的綜合體

細(xì)胞完成各種化學(xué)反應(yīng)

細(xì)胞需要和利用能量

細(xì)胞參與大量機(jī)械活動

細(xì)胞對刺激作出反應(yīng)

細(xì)胞是高度有序的，具有自組裝能力與自組織體系

細(xì)胞能進(jìn)行自我調(diào)控

繁殖和傳留后代原生質(zhì)體定義

《辭海生物學(xué)分冊》定義原生質(zhì)：任何細(xì)胞和非細(xì)胞形態(tài)的生活物質(zhì)都是由具有相似的基本組成成分和特性的“原生質(zhì)”構(gòu)成。

原生質(zhì)體一詞來源于原生質(zhì)，即由質(zhì)膜包圍的裸露細(xì)胞，又稱原生質(zhì)球。植物細(xì)胞：脫去細(xì)胞壁、獲得的裸露細(xì)胞，即其原生質(zhì)體。動物細(xì)胞：一個動物細(xì)胞就是一小團(tuán)原生質(zhì)體。暴露于5%NaCl溶液中的發(fā)生質(zhì)壁分離的植物細(xì)胞Sheenlab提取擬南芥原生質(zhì)體原生質(zhì)體作用

1、遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體：由于沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體可相對容易攝取DNA，染色體，細(xì)胞器，病毒等外源遺傳物質(zhì)。2、開辟雜種新途徑：是獲得細(xì)胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料，還可通過誘導(dǎo)形成雜種細(xì)胞。3、定向培養(yǎng)：將純化后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)條件下，使原生質(zhì)體適合于遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合、生理研究、體胚發(fā)生、器官發(fā)生等操作。原生質(zhì)體培養(yǎng)在植物快速繁殖、植物遠(yuǎn)緣遺傳重組、轉(zhuǎn)基因以及品種改良和創(chuàng)造新品種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。人教版選修三實驗原理介紹1、材料的選擇和預(yù)處理2、原生質(zhì)體分離3、原生質(zhì)體純化4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素6、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素8、原生質(zhì)體融合再生過程

起始材料及生理狀態(tài)對原生質(zhì)體的制備和其活力有很大影響。葉片可以大量獲取并且能得到比較均一的原生質(zhì)體，為最佳材料。此外，花期短的花瓣、根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織也可作為實驗材料。

1、材料選擇和預(yù)處理

材料的預(yù)處理可以改變細(xì)胞的生理狀態(tài)，增加細(xì)胞膜的強(qiáng)度，達(dá)到提高分離的效率和減少原生質(zhì)體損傷等。如在酶解前預(yù)先質(zhì)壁分離處理，因為此時原生質(zhì)體收縮封閉了胞間連絲，避免了細(xì)胞內(nèi)容物的流失。

用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

☆龍膽試管苗的葉片用4℃處理較好。

☆甘蔗植株在黑暗下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。

☆馬鈴薯試管苗葉片在黑暗下處理48h后分離原生質(zhì)體才能獲得高產(chǎn)量。

1、材料選擇和預(yù)處理

分離方法分為機(jī)械分離法和酶解分離法。

機(jī)械分離法：使細(xì)胞處于高滲溶液環(huán)境下，待其發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，磨碎組織，使原生質(zhì)體從傷口處流出。同時改變?nèi)芤簼舛?，使原生質(zhì)體復(fù)原。酶解分離法：植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，利用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。植物細(xì)胞壁組成：纖維素（35-50%），半纖維素（25-30%）木質(zhì)素（或果膠）（10-20%）2、原生質(zhì)體分離

原生質(zhì)體分離方法優(yōu)缺點(diǎn)比較2、原生質(zhì)體分離優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)機(jī)械分離法

避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用獲得量較少；能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。（細(xì)胞較大，高度液泡化）酶解分離法操作簡單，獲得量大，適用廣泛商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，會影響所獲原生質(zhì)體的活力優(yōu)缺點(diǎn)分離方法

原生質(zhì)體純化方法主要有離心沉淀法、漂浮法、界面法等，其原理都是利用原生質(zhì)體和雜質(zhì)比重不同而進(jìn)行分層。沉降法利用比重原理，在一定的滲透壓溶液內(nèi)低速離心，使完整的原生質(zhì)體沉于試管底部。漂浮法用較原生質(zhì)體比重大的滲透壓較高的溶液，使原生質(zhì)體漂浮于溶液表面。界面法用兩種比重不同的溶液，使健康和完整的原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中。3、原生質(zhì)體純化

形態(tài)識別：形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。

FDA(熒光素二乙酸)染色法：FDA本身無極性，無熒光，可自由出入細(xì)胞。但在活細(xì)胞中經(jīng)過酯酶的催化，轉(zhuǎn)化為熒光素。熒光素是熒光極性物質(zhì)，不能自由出入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)積累，而死細(xì)胞則不產(chǎn)生熒光素，不發(fā)出熒光。

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

臺盼藍(lán)染色法：完整細(xì)胞膜的排斥，沒活力或者受損的細(xì)胞顯藍(lán)色，有活力的細(xì)胞不吸收染料為無色。CFW(酚藏花紅)染色法：紅色的為死的原生質(zhì)體，活的原生質(zhì)體不著色。觀察胞質(zhì)環(huán)流法：顯微鏡下觀察具有胞質(zhì)環(huán)流者為代謝旺盛的原生質(zhì)體。氧電極法：用氧電極檢測放氧速率來代表呼吸代謝，光合作用活力。原生質(zhì)體存活率＝活的原生質(zhì)體數(shù)/觀察的原生質(zhì)體總數(shù)

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

產(chǎn)量測定一般用血球計數(shù)板法。讓滴出的原生質(zhì)懸液憑毛細(xì)管作用吸入計數(shù)室內(nèi)，剛好充滿計數(shù)室為宜(圖8－3)。靜置2min后計數(shù)，先用低倍鏡觀察，不均勻則拋棄。計數(shù)時用虹彩、集光器、反光鏡等調(diào)節(jié)入射光角度和強(qiáng)度，認(rèn)清計數(shù)室位置。采用“由上至下，由左至右，順序如弓”的順序，對壓邊線細(xì)胞采取“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則(圖8～4)。（1）供試材料及預(yù)處理方法。根據(jù)不同材料的不同性質(zhì)，確定相應(yīng)的預(yù)處理方式。（2）離心條件：離心次數(shù)、離心速度、離心時間。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素（3）

酶解條件：酶質(zhì)量

、組合、滲透壓、pH、濃度、光照和溫度、持續(xù)時間等。

酶解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用。酶解時，針對不同的取材會相應(yīng)的添加一些其他酶或調(diào)整不同酶的濃度。如：分離根尖原生質(zhì)體時加入崩潰酶，分離愈傷組織時加上半纖維素酶，從花粉中分離原生質(zhì)體時加入蝸牛酶。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素（3）

酶解條件：酶質(zhì)量、組合、滲透壓、pH、濃度、光照和溫度、持續(xù)時間等。

酶液的滲透壓必須與處理細(xì)胞的滲透壓相似。通常加入葡萄糖、甘露醇或者山梨醇等滲透劑調(diào)節(jié)。使用的濃度范圍因材料而異，一般0.35-0.8

mol/L，pH值為5.4-5.8。MES(嗎啉乙基磺酸)作為緩沖調(diào)節(jié)劑，可增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素6、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)直接于培養(yǎng)液中培養(yǎng)固體培養(yǎng)與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合培養(yǎng)固液雙層培養(yǎng)淺層培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基之上看護(hù)培養(yǎng)淺層培養(yǎng)于含看護(hù)細(xì)胞的固體培養(yǎng)基之上瓊脂糖培養(yǎng)與瓊脂糖混合培養(yǎng)，混合液滴加于器皿底部，凝固后滴加液體培養(yǎng)基7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素（1）植物基因型同一植物不同基因型的原生質(zhì)體脫分化與再分化所需要的條件不同，造成不同品種在相同條件下的再生能力也不盡相同。（2）原生質(zhì)體初植密度合理調(diào)整培養(yǎng)密度，過大，易形成競爭空間養(yǎng)分；過小影響植板率（3）滲透壓穩(wěn)定劑（4）培養(yǎng)基配方（5）培養(yǎng)條件7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)液里有無機(jī)物，有機(jī)物，激素，固化劑以及其它。無機(jī)物包括N,

P,

S,

K,Ca,

Mg(大量元素),Cu,Fe,Zn,B,Mn,Mo有機(jī)物包括碳源，維生素，氨基酸，有機(jī)酸，肌醇，天然復(fù)合物。激素包括生長素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。固化劑有瓊脂糖，瓊脂等。其它的包括抗生素等。注意：葡萄糖為首選碳源，培養(yǎng)基中要除去銨（對原生質(zhì)體存在有害），鐵、鋅也適當(dāng)減少，鈣濃度要增加2-4倍，為了改善膜穩(wěn)定性。8、原生質(zhì)體融合再生過程

通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交。

同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞

異核體：不同基因型的雜交細(xì)胞。8、原生質(zhì)體融合再生過程

根據(jù)是否人工誘導(dǎo)分為：自發(fā)融合和誘導(dǎo)融合自發(fā)融合率非常低，我們通常進(jìn)行人工誘導(dǎo)。

誘導(dǎo)融合方法：物理方法（電擊融合法）化學(xué)方法（聚乙二醇（PEG）細(xì)胞融合）生物方法（仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合）人教版選修三電擊細(xì)胞融合法細(xì)胞電融合原理:（1）通過雙向電泳使細(xì)胞間的接觸變得非常緊密:采用了高頻交流電，誘導(dǎo)細(xì)胞去極化，引起細(xì)胞聚集，排列成串珠狀，互相緊密接觸;（2）然后給予短暫的高壓脈沖，引起細(xì)胞膜的穿透，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細(xì)胞表面的張力作用，使兩個細(xì)胞融合逐步完成。為了穩(wěn)定這個過程，在短期內(nèi)需要施加交流電壓。（3）剛完成電融合的融合細(xì)胞可稱為異核體，盡管表面的細(xì)胞膜已經(jīng)發(fā)生了融合，細(xì)胞內(nèi)仍可以看到兩個或兩個以上的細(xì)胞核。隨后，細(xì)胞核也會在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生融合。8、原生質(zhì)體融合再生過程

聚乙二醇（PEG）細(xì)胞融合改良為PEG(聚乙二醇)高Ca2+高pH融合法。以PEG為融合劑的一種化學(xué)融合法，PEG與原生質(zhì)體膜結(jié)合后引起膜結(jié)構(gòu)紊亂，使得原生質(zhì)體互相聚集，在高Ca2+高pH條件下，原生質(zhì)體融合，完成融合過程。PEG在細(xì)胞融合中的作用：(1）促進(jìn)細(xì)胞凝聚；（2）改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處的磷脂分子層的脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細(xì)胞融合。8、原生質(zhì)體融合再生過程仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：仙臺病毒屬于RNA病毒，直徑為50-600μm，其質(zhì)膜表面存在兩種糖蛋白：一種是HANA蛋白，它具有凝集紅細(xì)胞能力和神經(jīng)氨酸普酶活性；一種是F蛋白，它具有質(zhì)膜融合能力、細(xì)胞融合能力和溶血能力。HANA蛋白使病毒吸附于細(xì)胞表面，并水解表面糖蛋白，F(xiàn)蛋白使兩原生質(zhì)體融合。

8、原生質(zhì)體融合再生過程

經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)的植株再生一般經(jīng)過細(xì)胞壁再生，細(xì)胞分裂成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織（或胚狀體）、植株再生這幾個過程。細(xì)胞壁再生：原生質(zhì)體在合適條件下（接種密度，碳源，激素以及光照等因素都影響其復(fù)壁率）短時間內(nèi)開始膨脹，葉綠體重排，并開始合成新的細(xì)胞壁，進(jìn)而由球形變成橢圓形。在原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，多數(shù)細(xì)胞能再生壁，但不同材料復(fù)壁的遲緩期差異很大。蠶豆10

min就開始復(fù)壁，煙草8-10

h復(fù)壁，小麥6-10

h復(fù)壁，水稻24

h復(fù)壁。利用細(xì)胞融合技術(shù)觀察蛋白質(zhì)運(yùn)動

利用細(xì)胞融合技術(shù)觀察蛋白質(zhì)運(yùn)動單克隆抗體的制備原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)原生質(zhì)體融合復(fù)壁具體實驗操作（1）植株培養(yǎng)將野生型本氏煙播種于培養(yǎng)基質(zhì)上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(光/暗周期為16/8h,相對濕度80%,光照度6000lx)。

市場上購買的小青菜幼葉。（2）預(yù)處理去除小青菜與煙草葉背表皮；采用EP管管蓋打孔取葉片2片（或取生長狀態(tài)良好的葉片適量,切成0.5mm的細(xì)絲）,用預(yù)質(zhì)壁分離液(組成為0.4mol/L甘露醇和10mmol/L氯化鈣)分離1h。二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)（3）酶解加入10mL酶液(1%的纖維素酶R-10、0.25%的果膠酶、6.8

mM氯化鈣、0.4M甘露醇,

pH5.5)。28(或37)℃對材料進(jìn)行14h靜置酶解。期間每半小時取出EP管，輕柔搖晃，促使酶液與材料充分接觸；（4）純化酶解結(jié)束后,依次用60目和100目的不銹鋼網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體溶液，濾去雜質(zhì),濾液分裝入2mLEP管,在600

r/min的條件下,離心5min,棄上清,沿管壁加入洗液（MS培養(yǎng)基）后繼續(xù)離心,如此重復(fù)1-3次，最后定容于0.5mL.。（沉降法）（5）計數(shù)

用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，計算4個角上大格及中央大格(共5個大格)內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)，然后按公式計算原生質(zhì)體數(shù)，每個樣品計數(shù)6個重復(fù)，最后計算出每克鮮重材料游離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量。原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/g)=5個大格內(nèi)總原生質(zhì)體數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)÷葉片質(zhì)量(g)二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)（6)活力檢測

取一滴EP管中下層原生質(zhì)體溶液，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)撕去下表皮酶解前后10倍鏡下的原生質(zhì)體40倍鏡下的原生質(zhì)體三、原生質(zhì)體融合復(fù)壁

參考王金發(fā)等編撰的《細(xì)胞生物學(xué)實驗教程（第二版）》(1)取一干凈離心管，輕柔加入煙草原生質(zhì)體0.1ml，再沿管壁逐滴加入小青菜原生質(zhì)體0.1ml；

(2)靜置10-15min，使原生質(zhì)體貼于管底或管壁。(3)用吸管吸取PEG3350溶液，等體積（0.2ml）緩慢加于原生質(zhì)體液面上，靜置10—15min。在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體粘連情況。(4)用吸管向原生質(zhì)體液滴中慢慢加入高pH高鈣洗滌稀釋液3次，每次0.5mL，每次間隔5

min。(5)600rpm離心5min，棄上清，再緩慢加入2mL高pH高鈣洗滌稀釋液，5min后再次離心；。(6)

棄上清，用MS培養(yǎng)基如上換洗兩次，加入1mLMS培養(yǎng)基，蓋上管，置于26℃培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)到弱光下培養(yǎng)。三、原生質(zhì)體融合復(fù)壁(7)觀察融合復(fù)壁過程。取一滴原生質(zhì)體懸浮液滴在載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察。培養(yǎng)兩周后，可以發(fā)展成細(xì)胞團(tuán)。這時應(yīng)該添加新鮮培養(yǎng)基，滲透壓減半。一般培養(yǎng)24h后可以觀察到再生細(xì)胞壁。三、原生質(zhì)體融合復(fù)壁

理論課加實驗課，理論課講解實驗原理知識。設(shè)置兩次實驗課。主要以體驗實驗過程，運(yùn)用理論知識分析實驗結(jié)果為主。1、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)，在酶解等待時可以介紹廖嘉明等人所做實驗的實驗步驟。讓同學(xué)們和自己所做的實驗進(jìn)行對比，對實驗結(jié)果形成原因進(jìn)行分析和提出實驗改進(jìn)。2、原生質(zhì)體融合復(fù)壁實驗關(guān)鍵是讓學(xué)生觀察復(fù)壁的過程，以及意識到分離純化原生質(zhì)體對該實驗的影響。四、課程安排五、幾種細(xì)胞融合的成功例子人教版選修三題目

（2015浙江寧波市鄞州中學(xué)測試）科學(xué)家以番茄（2N）和馬鈴薯（4N）為材料利用下圖技術(shù)得到“番茄-馬鈴薯”植株．請回答下列問題：（1）獲得a,b所選用的酶為

，c,d的名稱依次是，

。（2）圖示技術(shù)名稱是

；由d培育成植株的過程運(yùn)用的技術(shù)手段是

，其依據(jù)的原理是。（3）過程稱為，所用的化學(xué)誘導(dǎo)劑一般是，過程成功的標(biāo)志是。（4）過程④是，⑤過程增值的方式為。誘導(dǎo)f中植株生根過程中培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比較值較④過程

（高/低）；最終獲得的“番茄-馬鈴薯屬于”

倍體植株。

纖維素酶和果膠酶植物細(xì)胞全能性PEG(聚乙二醇)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)原生質(zhì)體融合脫分化（形成新細(xì)胞壁）雜種細(xì)胞原生質(zhì)的培養(yǎng)雜種細(xì)胞再生細(xì)胞壁有絲分裂(正在融合的)原生質(zhì)體高六題目

（2017浙江臺州選考質(zhì)檢）某科研團(tuán)隊利用植物細(xì)胞工程技術(shù)，把基因序列已知的抗除草劑（Bar）基因?qū)朐|(zhì)體獲得抗除草劑大豆。請回答下列相關(guān)問題：

(1)對于已獲得的Bar基因可以用

技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。圖中的a過程通常使用相同的

酶和DNA連接酶，使目的基因與載體連接形成重組DNA。(2)在b過程中，獲得原生質(zhì)體除了需要纖維素酶和果膠酶，還需要用到的試劑是

。(3)成功導(dǎo)入重組DNA的原生質(zhì)體經(jīng)脫分化形成I

,進(jìn)而生長發(fā)育成植株。下列不屬于Ⅰ細(xì)胞應(yīng)具有的特征是

。A.薄壁細(xì)胞B.細(xì)胞質(zhì)豐富C.液泡小D.細(xì)胞核小(4)若要判斷轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆是否成功，比較簡便的檢測方法是

。PCR

限制性核酸內(nèi)切適宜濃度的甘露醇愈傷組織D用一定濃度的除草劑噴灑，觀察轉(zhuǎn)基因大豆的生長情況參考文獻(xiàn)[1]彭邵鋒,陸佳,陳永忠,等.木本植物原生質(zhì)體培養(yǎng)體系研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(1):1-6.[2]王莉,姚占軍.植物原生質(zhì)體的制備與活力檢測研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2009(s1):46-50.[3]梅興國,潘學(xué)武,董妍玲.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)方法[J].生物學(xué)通報,2001,36(7):14-15.[4]徐文錦,劉湘,寧勇.植物原生質(zhì)體融合技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2008,32(1):46-48.[5]李文安.第八講植物原生質(zhì)體培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)報,1979(3):52-59.[6]張穎.唐菖蒲原生質(zhì)體分離、純化及培養(yǎng)的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.[7]李春艷,李妮亞,陳少良.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合的研究進(jìn)展[J].海南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,18(3):264-268.[8]LentzBR,LeeJK.Poly(e