蛋白質(zhì)定性定量分析培訓(xùn)教材

2024/9/271蛋白質(zhì)的定性定量分析第二章2024/9/272蛋白質(zhì)的含量測(cè)定凱氏定氮法：1883年丹麥化學(xué)家Kjeldhl建立，經(jīng)后人改良后形成的一種定量測(cè)定蛋白質(zhì)最為精確、敏感的方法。原理：蛋白質(zhì)的含氮量為16％，只要測(cè)出樣品中氮的含量，即可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量樣品中蛋白質(zhì)的含量＝N×6.252024/9/273凱氏定氮的基本流程：1、消化：生物樣品與濃硫酸共煮，樣品蛋白質(zhì)被無(wú)機(jī)化，其中氮元素轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@。Pr＋H2SO4CO2＋H2O＋(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NaOHNH4OH+H2SO4NH4OH+HClNH4Cl+H2O2024/9/2752024/9/2762024/9/277凱氏法的評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、適用于一切形態(tài)的樣品；2、不用比色，對(duì)混濁不透明的樣品也可進(jìn)行分析；3、結(jié)果的精、準(zhǔn)度較高。1、樣品中含有非蛋白態(tài)氮時(shí)影響分析結(jié)果；2、組成蛋白質(zhì)的氨基酸可影響分析結(jié)果；3、操作復(fù)雜，對(duì)操作者的要求高。2024/9/278Lowry法Lowry法原理：是在雙縮脲法和Folin酚法的基礎(chǔ)上建立的一種新的蛋白質(zhì)定量方法。蛋白質(zhì)在堿性條件下與銅離子反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物。然后再與Folin試劑反應(yīng)生物深藍(lán)色。顏色與蛋白質(zhì)含量成正比，符合朗伯－比爾定律。2024/9/279方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)1、可對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分析，操作簡(jiǎn)便；2、結(jié)合Folin酚法，提高了分析的靈敏度；3、結(jié)合雙縮脲法，避免了Folin酚法的局限。缺點(diǎn)1、比色測(cè)定，要求顯色后溶液透明，且樣品必需可溶；2、酚方式劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，顯色后需盡快比色；3、干擾反應(yīng)的因素較多。2024/9/271000.20.40.60.81.0mg/mlA0.80.60.40.22024/9/27112024/9/2712紫外吸收法原理：蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有兩個(gè)吸收峰，其一為280nm，由芳香氨基酸上共軛雙鍵引起，芳香氨基酸在各種蛋白質(zhì)的的含量差別不大，測(cè)蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸收值可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽鍵引起?？赏ㄟ^(guò)215nm與225nm的差值計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。2024/9/2713考馬斯亮藍(lán)G-250染色法原理：考馬斯亮藍(lán)在一定濃度的乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰從465nm移到596nm。優(yōu)點(diǎn)：（1）操作簡(jiǎn)便；（2）敏感度較高（3）顏色穩(wěn)定（4）對(duì)干擾劑不敏感。缺點(diǎn)：（1）染料與蛋白質(zhì)的實(shí)際狀況復(fù)雜，色素與樣品中的蛋白質(zhì)不一定以當(dāng)量相結(jié)合；（2）要求樣品完全溶解；（3）樣品不能回收使用。2024/9/2714蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的測(cè)定SDS－PAGE法測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量：帶電顆粒在電場(chǎng)中的遷移主要受三個(gè)因素的作用，即場(chǎng)強(qiáng)、顆粒本身的電荷及分子形狀。因此一般電泳無(wú)法直接測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。加入變性劑SDS后，蛋白質(zhì)變性肽鏈伸展且蛋白質(zhì)所帶電荷被SDS的負(fù)電荷覆蓋，在相同的電場(chǎng)下，蛋白質(zhì)的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)。2024/9/2715lgMr=lgK-bm=K1-bm2024/9/2716SDS法測(cè)定分子量的操作：1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備：按商品說(shuō)明書(shū)使用。2、待測(cè)樣品的制備：取待測(cè)蛋白質(zhì)樣品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)1ml溶解。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)一起加入等體積的樣品緩沖液，混勻，沸水浴加熱3分鐘后上樣。3、電泳分離及染色：2024/9/27174、計(jì)算相對(duì)遷移率：Rf=蛋白樣品移動(dòng)距離(cm)指示染料移動(dòng)距離(cm)2024/9/27182024/9/27192024/9/2720凝膠過(guò)濾測(cè)蛋白質(zhì)分子量：測(cè)定大分子的分子量是凝膠過(guò)濾的應(yīng)用之一。將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過(guò)濾層析，由于加入凝膠柱的物質(zhì)分子質(zhì)量不同，洗脫體積也不同?？筛鶕?jù)洗脫體積求出柱的分配常數(shù)Kav，而Kav與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量之間又存在線性關(guān)系，利用這一關(guān)系可繪制出Kav與分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2024/9/27212024/9/2722Ve＝K1－K2logMr2024/9/27232024/9/27242024/9/2725方法的局限性：1、在pH6～8的范圍內(nèi)，直線關(guān)系比較好，在極端pH時(shí)因蛋白質(zhì)變性而引起偏離；2、分子量與分配系數(shù)Kav有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的軸比較大時(shí)，會(huì)引起測(cè)定偏離；3、糖蛋白的含糖量大于5％時(shí)，測(cè)得的分子量比真實(shí)分子量大。2024/9/27262024/9/2727沉降速度法S＝＝＝沉降速度離心力dx/dtω2x1dtω2dxxm=SRTD(1-υρ)2024/9/2728沉降平衡法m=2RTln(C1/C2)(1-υρ)ω2(X22-X12)2024/9/2729等電聚焦測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn)分析：電泳結(jié)束后三氯乙酸固定并除去凝膠中的載體兩性電解質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)R－250染色，漂洗顯帶后測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。1、利用已知等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為縱坐標(biāo)，距正極的距離為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)待測(cè)樣品的位置求出其等電點(diǎn)；2024/9/27302、利用微電極直接測(cè)定凝膠表面的pH而得知樣品的等電點(diǎn)；3、將凝膠切成等距離(5nm)的小塊，浸于水中，用精密試紙測(cè)定pH。以凝膠塊距正極的距離為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)作用圖得出膠的pH梯度曲線。根據(jù)待測(cè)樣品在凝膠中的位置而得出蛋白質(zhì)樣品的等電點(diǎn)。2024/9/2731其它蛋白質(zhì)定性定量分析技術(shù)蛋白質(zhì)的電泳染色定量分析特定蛋白質(zhì)在總蛋白中所點(diǎn)比例的分析：最早應(yīng)用于血漿蛋白電泳分離后白蛋白和球蛋白的比例測(cè)定。其方法有二，其一是將染色后的蛋白區(qū)帶剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛『蟊壬珳y(cè)定；其二用反射掃描儀處理后，計(jì)算各峰面積比而得出各成分的相對(duì)含量。與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白一起電泳染色掃描后與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較，得出樣品蛋白的含量。2024/9/273220