2.2.2動物細(xì)胞融合與單克隆抗體的制備公開課一等獎?wù)n件省賽課獲獎?wù)n件

？？？？再分化？植物細(xì)胞雜交技術(shù)利用什么原理？用什么方法可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合？一、原理：細(xì)胞膜含有流動性細(xì)胞的全能性二、誘導(dǎo)辦法：離心振動電激、聚乙二醇植物細(xì)胞雜交技術(shù)有什么用途？三、用途：獲得雜種植株脫分化一、動物細(xì)胞融合有些細(xì)胞的融合是正常的生命活動。如精子與卵細(xì)胞的結(jié)合。

兩個細(xì)胞正在融合受精作用(一)概念動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一種細(xì)胞的過程。（二）動物細(xì)胞融合的過程與植物原生質(zhì)體融合原理相似，辦法類似。雜交細(xì)胞:融合后形成的含有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。一、動物細(xì)胞融合⑴.原理：1、動物細(xì)胞融合的基本原理是什么？2、動物細(xì)胞融合的誘導(dǎo)方式是什么？與植物細(xì)胞融合的誘導(dǎo)方式有什么不同？與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相似，即細(xì)胞膜的流動性。⑵.誘導(dǎo)方式：物理法：電激、振動、離心化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的病毒例如：仙臺病毒仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細(xì)胞）保存融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）細(xì)胞A細(xì)胞B雜交細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動性）(三)動物細(xì)胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交辦法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種哺育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。二、單克隆抗體（一）、什么是抗體？抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的含有免疫功效的球蛋白。

三、單克隆抗體1、抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）2、抗體是如何產(chǎn)生的？B淋巴細(xì)胞抗原增殖分化成漿細(xì)胞3、一種B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生幾個抗體？一種（二）獲得抗體的傳統(tǒng)辦法1、把某種抗原重復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需的抗體。2、缺點：產(chǎn)量低，純度低，特異性差。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反映的過程中，體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每一種B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。

1、請從以上文字資料中找出單克隆抗體的概念用單個B淋巴細(xì)胞進(jìn)行（無性繁殖）克隆，得到的基因型相似的細(xì)胞群能夠分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。1、在體外培養(yǎng)的條件下，一種B淋巴細(xì)胞有無可能無限增殖？不可能2、我們學(xué)過的什么細(xì)胞含有這樣的能力？癌細(xì)胞3、有什么方法讓B淋巴細(xì)胞也含有這樣的能力？細(xì)胞融合一種B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖雜種細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（三）、實驗原理：動物細(xì)胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能快速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體，柯勒如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？運用B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功效。運用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性。運用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得含有B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞。運用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。應(yīng)用：動物細(xì)胞融合設(shè)計方案：一種B淋巴細(xì)胞——只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞——能無限增殖化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)雜種細(xì)胞單克隆抗體的制備單克隆抗體的特點：（四）、單克隆抗體的制備過程3.過程：①免疫動物注射抗原的目的是什么？獲得能產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）誘導(dǎo)細(xì)胞融合常用方法是什么？滅活的仙臺病毒如何進(jìn)行篩選？具有篩選作用的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）？種BB、B瘤、瘤瘤、雜交細(xì)胞如何獲得大量的單克隆抗體？②免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備③細(xì)胞融合④雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)⑤雜交瘤細(xì)胞的篩選⑥分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立⑦單克隆抗體的大量制備？

？抗原效應(yīng)B細(xì)胞篩選篩選（AA型、BB型）AB型雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞過程：抗原小鼠效應(yīng)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選多孔培養(yǎng)板單個細(xì)胞培養(yǎng)，篩選能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)提取出單克隆抗體考考你！1.在制備單克隆抗體的過程中，選用哪兩種細(xì)胞進(jìn)行融合？為什么選擇這兩種細(xì)胞？漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞漿細(xì)胞能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖；骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖，但不能產(chǎn)生單一抗體?？伎寄?！2、在這過程中進(jìn)行了幾次篩選？分別在哪個環(huán)節(jié)進(jìn)行篩選？兩次篩選。第一次在B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后來篩選出雜交瘤細(xì)胞；第二次在雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。五、單克隆抗體的應(yīng)用請同學(xué)們根據(jù)自己所收集的資料，談?wù)剢慰寺】贵w的應(yīng)用。１、可用于作為診療試劑：有精確，高效，簡易、快速的優(yōu)點２、可用于疾病治療３、可用于運載藥品（作為運載對應(yīng)疾病的藥品的“生物導(dǎo)彈“。）“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥品小結(jié)

細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合

漿篩選

瘤細(xì)胞

雜交細(xì)胞培養(yǎng)選出能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群繼續(xù)培養(yǎng)體外培養(yǎng)

體內(nèi)培養(yǎng)從培養(yǎng)液或小鼠腹水中取出

單克隆抗體通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得的雜交瘤細(xì)胞群產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。植物體細(xì)胞雜交、動物細(xì)胞融合的比較三.細(xì)胞工程比較重要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)辦法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的辦法細(xì)胞膜流動性細(xì)胞增殖細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項目克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性的障礙1、動物細(xì)胞融合和植物原生質(zhì)體融合比較，在動物細(xì)胞融合中有特殊性的是（）A、融合的原理B、融合的優(yōu)點C、融合的誘導(dǎo)手段D、融合的過程2、動物細(xì)胞融合的目的中最重要的是（）A、克服遠(yuǎn)緣雜交不親和B、制備單克隆抗體C、哺育新物種D、生產(chǎn)雜種細(xì)胞3、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與某種細(xì)胞融合，得到雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細(xì)胞融合的是（）A、通過免疫的B淋巴細(xì)胞B、不通過免疫的T淋巴細(xì)胞C、通過免疫的T淋巴細(xì)胞D、不通過免疫的B淋巴細(xì)胞4.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞本身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞本身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③5、研究單克隆抗體治療癌癥的思路是（）A．運用單克隆抗體特異性地對抗癌細(xì)胞B．以單克隆抗體作抗癌藥品殺死癌細(xì)胞C．抗癌物質(zhì)在克隆細(xì)胞中大量合成D．單克隆抗體攜帶抗癌藥品特異性地與癌細(xì)胞結(jié)合6．只能使動物細(xì)胞融合的慣用誘導(dǎo)辦法（）A．PEGB．滅活的病毒C．電刺激D．離心7、“生物導(dǎo)彈”是指（）A.單克隆抗體B.雜交瘤細(xì)胞C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞D.在單抗上連接抗癌藥品8、下列有關(guān)單克隆抗體的制備和應(yīng)用的敘述中，不對的的是（）A．B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，普通不

需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)B．融合后形成的雜交瘤細(xì)胞既能無限增殖，又

能產(chǎn)生單克隆抗體C．體外培養(yǎng)時，一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生

抗體，但不能無限增殖D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強(qiáng)，靈

敏度高，優(yōu)越性明顯A9.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞本身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞本身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一種雜交瘤細(xì)胞的狀況下，培養(yǎng)得到的細(xì)胞群是單個雜交瘤細(xì)胞克隆得來的，因此產(chǎn)生的抗體必然是化學(xué)性質(zhì)單一的，特異性強(qiáng)的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細(xì)胞克隆的含義，只但是克隆的不是B淋巴細(xì)胞，而是雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能快速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。思考與探究1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相似，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。誘導(dǎo)融合辦法不同：動物細(xì)胞誘導(dǎo)融合所用的辦法比植物體細(xì)胞雜交多一類滅活的病毒誘導(dǎo)；成果不同：植物體細(xì)胞雜交培養(yǎng)成了雜種植株，而動物細(xì)胞融合只培養(yǎng)出了雜交細(xì)胞。2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成對應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌對應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反映的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞含有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不停增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。知識拓展3.為什么不只用兩個而要用多個細(xì)胞進(jìn)行動物細(xì)胞間的融合？就現(xiàn)在慣用的細(xì)胞融合辦法來看，不管是用物理的、化學(xué)的辦法，還是生物的辦法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者盼望得到的細(xì)胞類型?，F(xiàn)在動物細(xì)胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來闡明這一問題。我們懂得，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上，但是每一種B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一種脾細(xì)胞（含B淋巴細(xì)胞）和一種瘤細(xì)胞雜交，我們不能擬定該脾細(xì)胞分泌的抗體與否正是我們所需要的；若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，就能夠從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。知識拓展4.如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，普通用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超出一種，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（慣用酶聯(lián)免疫吸附實驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能確保是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，普通需進(jìn)行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。知識拓展6.單倍體的誘導(dǎo)辦法及應(yīng)用價值單倍體（haploid）是指含有配子染色體數(shù)目的個體。單倍體能夠自發(fā)產(chǎn)生，也能夠誘發(fā)產(chǎn)生。動物中（除蜜蜂、白蟻等外）的單倍體，由于生理上不正常，在胚胎發(fā)育時期就會死亡。植物上自發(fā)產(chǎn)生單倍體的植物諸多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麥、小麥、油菜等，共有約10個科26個屬36個種的植物能夠自發(fā)產(chǎn)生單倍體。除了自發(fā)產(chǎn)生單倍體外，人工誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的辦法有：（1）種間和屬間雜交。由于遠(yuǎn)緣雜交，即使不能受精，但在遠(yuǎn)緣物種的花粉誘導(dǎo)下，卵細(xì)胞能夠在未受精狀況下發(fā)育成胚，這種狀況在馬鈴薯、大麥、小麥、玉米中都能夠發(fā)生；（2）物理和化學(xué)誘變?；ǚ劢?jīng)射線照射或化學(xué)藥品解決失去受精能力，但仍能夠刺激