2.2.2動物細胞融合與單克隆抗體的制備公開課一等獎課件省賽課獲獎課件

？？？？再分化？植物細胞雜交技術利用什么原理？用什么方法可以誘導植物細胞融合？一、原理：細胞膜含有流動性細胞的全能性二、誘導辦法：離心振動電激、聚乙二醇植物細胞雜交技術有什么用途？三、用途：獲得雜種植株脫分化一、動物細胞融合有些細胞的融合是正常的生命活動。如精子與卵細胞的結(jié)合。

兩個細胞正在融合受精作用(一)概念動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一種細胞的過程。（二）動物細胞融合的過程與植物原生質(zhì)體融合原理相似，辦法類似。雜交細胞:融合后形成的含有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。一、動物細胞融合⑴.原理：1、動物細胞融合的基本原理是什么？2、動物細胞融合的誘導方式是什么？與植物細胞融合的誘導方式有什么不同？與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相似，即細胞膜的流動性。⑵.誘導方式：物理法：電激、振動、離心化學法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的病毒例如：仙臺病毒仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細胞）保存融合活性（誘導細胞融合）細胞A細胞B雜交細胞滅活的病毒物理法化學法滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜交細胞（細胞膜具有一定的流動性）(三)動物細胞融合的應用1.突破有性雜交辦法的局限,使遠緣雜交成為可能。2.成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種哺育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。二、單克隆抗體（一）、什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的含有免疫功效的球蛋白。

三、單克隆抗體1、抗體是由何種細胞產(chǎn)生的？漿細胞（效應B細胞）2、抗體是如何產(chǎn)生的？B淋巴細胞抗原增殖分化成漿細胞3、一種B淋巴細胞能產(chǎn)生幾個抗體？一種（二）獲得抗體的傳統(tǒng)辦法1、把某種抗原重復注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需的抗體。2、缺點：產(chǎn)量低，純度低，特異性差。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反映的過程中，體內(nèi)的B淋巴細胞能夠產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每一種B細胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。

1、請從以上文字資料中找出單克隆抗體的概念用單個B淋巴細胞進行（無性繁殖）克隆，得到的基因型相似的細胞群能夠分泌一種化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。1、在體外培養(yǎng)的條件下，一種B淋巴細胞有無可能無限增殖？不可能2、我們學過的什么細胞含有這樣的能力？癌細胞3、有什么方法讓B淋巴細胞也含有這樣的能力？細胞融合一種B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖雜種細胞動物細胞培養(yǎng)技術（三）、實驗原理：動物細胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能快速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體，柯勒如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？運用B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功效。運用腫瘤細胞無限增殖的特性。運用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得含有B淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞。運用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞。應用：動物細胞融合設計方案：一種B淋巴細胞——只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞——能無限增殖化學性質(zhì)單一、特異性強雜種細胞單克隆抗體的制備單克隆抗體的特點：（四）、單克隆抗體的制備過程3.過程：①免疫動物注射抗原的目的是什么？獲得能產(chǎn)生相應抗體的B淋巴細胞（漿細胞）誘導細胞融合常用方法是什么？滅活的仙臺病毒如何進行篩選？具有篩選作用的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）？種BB、B瘤、瘤瘤、雜交細胞如何獲得大量的單克隆抗體？②免疫B細胞和骨髓瘤細胞的制備③細胞融合④雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)⑤雜交瘤細胞的篩選⑥分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立⑦單克隆抗體的大量制備？

？抗原效應B細胞篩選篩選（AA型、BB型）AB型雜交瘤細胞能產(chǎn)生所需抗體的細胞過程：抗原小鼠效應B細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞融合、篩選多孔培養(yǎng)板單個細胞培養(yǎng)，篩選能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)提取出單克隆抗體考考你！1.在制備單克隆抗體的過程中，選用哪兩種細胞進行融合？為什么選擇這兩種細胞？漿細胞和骨髓瘤細胞漿細胞能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖；骨髓瘤細胞能無限增殖，但不能產(chǎn)生單一抗體。考考你！2、在這過程中進行了幾次篩選？分別在哪個環(huán)節(jié)進行篩選？兩次篩選。第一次在B細胞和骨髓瘤細胞融合后來篩選出雜交瘤細胞；第二次在雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。五、單克隆抗體的應用請同學們根據(jù)自己所收集的資料，談談單克隆抗體的應用。１、可用于作為診療試劑：有精確，高效，簡易、快速的優(yōu)點２、可用于疾病治療３、可用于運載藥品（作為運載對應疾病的藥品的“生物導彈“。）“生物導彈”＝單克隆抗體＋藥品小結(jié)

細胞骨髓瘤細胞細胞融合

漿篩選

瘤細胞

雜交細胞培養(yǎng)選出能產(chǎn)生特定抗體的細胞群繼續(xù)培養(yǎng)體外培養(yǎng)

體內(nèi)培養(yǎng)從培養(yǎng)液或小鼠腹水中取出

單克隆抗體通過細胞融合技術獲得的雜交瘤細胞群產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。植物體細胞雜交、動物細胞融合的比較三.細胞工程比較重要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學（聚乙二醇）誘導辦法使細胞分散后誘導細胞融合去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合細胞融合的辦法細胞膜流動性細胞增殖細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目克服遠緣雜交不親和性的障礙1、動物細胞融合和植物原生質(zhì)體融合比較，在動物細胞融合中有特殊性的是（）A、融合的原理B、融合的優(yōu)點C、融合的誘導手段D、融合的過程2、動物細胞融合的目的中最重要的是（）A、克服遠緣雜交不親和B、制備單克隆抗體C、哺育新物種D、生產(chǎn)雜種細胞3、科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是（）A、通過免疫的B淋巴細胞B、不通過免疫的T淋巴細胞C、通過免疫的T淋巴細胞D、不通過免疫的B淋巴細胞4.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞本身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞本身融合細胞⑤雜交瘤細胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③5、研究單克隆抗體治療癌癥的思路是（）A．運用單克隆抗體特異性地對抗癌細胞B．以單克隆抗體作抗癌藥品殺死癌細胞C．抗癌物質(zhì)在克隆細胞中大量合成D．單克隆抗體攜帶抗癌藥品特異性地與癌細胞結(jié)合6．只能使動物細胞融合的慣用誘導辦法（）A．PEGB．滅活的病毒C．電刺激D．離心7、“生物導彈”是指（）A.單克隆抗體B.雜交瘤細胞C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞D.在單抗上連接抗癌藥品8、下列有關單克隆抗體的制備和應用的敘述中，不對的的是（）A．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，普通不

需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導B．融合后形成的雜交瘤細胞既能無限增殖，又

能產(chǎn)生單克隆抗體C．體外培養(yǎng)時，一種效應B淋巴細胞能夠產(chǎn)生

抗體，但不能無限增殖D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強，靈

敏度高，優(yōu)越性明顯A9.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞本身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞本身融合細胞⑤雜交瘤細胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一種雜交瘤細胞的狀況下，培養(yǎng)得到的細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，因此產(chǎn)生的抗體必然是化學性質(zhì)單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只但是克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能快速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。思考與探究1.植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術有什么不同？植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術基本相似，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。誘導融合辦法不同：動物細胞誘導融合所用的辦法比植物體細胞雜交多一類滅活的病毒誘導；成果不同：植物體細胞雜交培養(yǎng)成了雜種植株，而動物細胞融合只培養(yǎng)出了雜交細胞。2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成對應的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌對應的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反映的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞含有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不停增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。知識拓展3.為什么不只用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？就現(xiàn)在慣用的細胞融合辦法來看，不管是用物理的、化學的辦法，還是生物的辦法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者盼望得到的細胞類型。現(xiàn)在動物細胞融合技術最有價值的應用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來闡明這一問題。我們懂得，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一種B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一種脾細胞（含B淋巴細胞）和一種瘤細胞雜交，我們不能擬定該脾細胞分泌的抗體與否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就能夠從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。知識拓展4.如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，普通用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超出一種，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（慣用酶聯(lián)免疫吸附實驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能確保是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，普通需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。知識拓展6.單倍體的誘導辦法及應用價值單倍體（haploid）是指含有配子染色體數(shù)目的個體。單倍體能夠自發(fā)產(chǎn)生，也能夠誘發(fā)產(chǎn)生。動物中（除蜜蜂、白蟻等外）的單倍體，由于生理上不正常，在胚胎發(fā)育時期就會死亡。植物上自發(fā)產(chǎn)生單倍體的植物諸多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麥、小麥、油菜等，共有約10個科26個屬36個種的植物能夠自發(fā)產(chǎn)生單倍體。除了自發(fā)產(chǎn)生單倍體外，人工誘導產(chǎn)生單倍體的辦法有：（1）種間和屬間雜交。由于遠緣雜交，即使不能受精，但在遠緣物種的花粉誘導下，卵細胞能夠在未受精狀況下發(fā)育成胚，這種狀況在馬鈴薯、大麥、小麥、玉米中都能夠發(fā)生；（2）物理和化學誘變?；ǚ劢?jīng)射線照射或化學藥品解決失去受精能力，但仍能夠刺激