《血紅蛋白的提取和分離》復習課件

課題3血紅蛋白的提取和分離1.通過進行探究實驗，結合觀看實驗視頻，能夠嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2.通過閱讀資料，結合教師講解，能夠了解色譜法、電泳法等分離生物大分子基本原理1.透析法分離蛋白質的目的是除去小分子

雜質。

2．利用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對

分子質量大的先洗脫出來，相對分子

質量小的后洗脫出來。3．在電泳中，待分離樣品中分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀都會影響分子的遷移速度。4．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率完全取決于分子的大小。5．蛋白質提取和分離的一般步驟是：樣品處理與粗分離、純化和純度鑒定。蛋白質特性的差異①分子的

②所帶的

性質和多少③溶解度④吸附性質⑤對其他分子的

形狀和大小電荷親和力1．蛋白質分離的理論依據蛋白質分離的原理和方法2．分離的方法(1)凝膠色譜法：根據

分離蛋白質的一種有效方法，也稱做

法。

(2)電泳：①概念：指

在電場的作用下發(fā)生

的過程。②原理：在一定的

下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團會帶上

，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷

的電極移動。相對分子質量的大小分配色譜帶電粒子遷移pH正電或負電相反③影響電泳效果的因素：帶電性質大小形狀遷移速度④方法：常用的電泳方法有

電泳和

電泳。瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠3．緩沖溶液(1)配制：由1～2種

溶解于水中配制而成，通過調節(jié)緩沖劑的

就可以得到不同pH范圍內使用的緩沖液。(2)作用：在一定范圍內，抑制外界的

對溶液pH的影響，維持pH基本不變。緩沖劑使用比例酸和堿1．凝膠色譜法(1)凝膠：是一些微小多孔的球體，內含許多貫穿的通道，具有多孔的凝膠，又稱為分子篩。(2)原理：相對分子質量大相對分子質量小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被排阻在外面小于凝膠顆粒空隙直徑，可以進入顆粒內部運動方式垂直向下移動無規(guī)則擴散進入凝膠顆粒運動速度較快較慢運動路程較短較長洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來2．電泳的常用方法(1)瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場中的遷移速率因各種分子的帶電性質差異、分子大小、形狀不同而不同，從而得以分離。(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳：①凝膠形成：單體(丙烯酰胺)＋交聯(lián)劑(N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺)引發(fā)劑和催化劑三維網狀結構凝膠②加入SDS的作用：使蛋白質發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈，與各種蛋白質形成蛋白質-SDS復合物，SDS所帶負電荷的量遠遠超過了蛋白質分子原有電荷量，掩蓋了不同蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。[特別提醒]

測定蛋白質相對分子質量通常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，原因是在一定濃度范圍內聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定性強，可用檢測儀直接測定。雜蛋白1．樣品處理(1)紅細胞的洗滌：①目的：去除

，以利于后續(xù)步驟的分離純化。②措施：分離(低速短時間離心)→用膠頭吸管吸去上層透明黃色血漿→下層暗紅色的紅細胞用生理鹽水洗滌(如此重復三次)。實驗操作(2)血紅蛋白的釋放：①目的：使紅細胞破裂釋放

。②過程：血紅蛋白甲苯（3）分離血紅蛋白溶液①將混合液

②將試管中的液體用

過濾③除去

④于

中靜置片刻⑤分離出下層的紅色透明液體離心濾紙脂溶性沉淀層分液漏斗2．粗分離——透析(1)方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入一定量適宜濃度的磷酸緩沖液中，透析12h。(2)目的：將

的雜質除去。

(3)原理：透析袋能使

自由進出，而將

保留在袋內。小分子大分子物質相對分子質量較小3．純化通過凝膠色譜法將相對分子質量較大的雜質蛋白除去。(1)凝膠色譜柱的制作：①取長40cm，內徑為1.6cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②柱底制作：打孔→挖凹穴→安裝

→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。③柱頂制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝，并在下端出口連接帶開關的尼龍管，尼龍管放入收集器。移液管頭部(2)凝膠色譜柱的裝填：①色譜柱固定于支架上。②干凝膠的計算和稱量。③溶脹：干凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成

。④裝填：打開

，將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內。⑤洗滌平衡：裝填完后，立即連接洗脫瓶，用20mmol/L的磷酸緩沖液洗滌平衡凝膠12h。凝膠懸浮液下端出口(3)樣品的加入和洗脫：①調整緩沖液面：與

平齊

②滴加透析樣品：用量為1mL

③樣品滲入凝膠床：樣品完全進入凝膠層

④洗脫：打開下端出口，用

洗脫

⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱

時，用試管收集流出液，每試管5mL，連續(xù)收集凝膠面磷酸緩沖液底端1．洗滌紅細胞時能否用蒸餾水代替生理鹽水？提示：不能。生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂，在未洗凈血漿中的雜質蛋白前，紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。2．血紅蛋白釋放過程加入蒸餾水和甲苯目的是什么？提示：加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。細胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有機溶劑，加入甲苯能加速紅細胞破裂以釋放血紅蛋白。

3．血紅蛋白呈現紅色，這一特點對進行蛋白質的分離有什么意義？提示：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。

實驗結果分析與評價1．對血液樣品處理后樣品發(fā)生的變化(1)正?，F象：血紅蛋白與氧氣結合呈鮮紅色，與二氧化碳結合呈暗紅色，所以剛分離的血紅蛋白溶液呈紅色。(2)分層不明顯的原因：洗滌次數少，未完全除去血漿蛋白。(3)紅細胞不純凈的原因：離心速度過高或時間過長，使白細胞和淋巴細胞一同沉淀而造成。2．判斷裝填的凝膠色譜柱成功與否（1）方法在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈檢查凝膠是否裝填均勻加入大分子的有色物質，觀察色帶移動情況（2）成功的標準其調整若色帶均勻、狹窄、平整，說明性能良好若色譜柱內出現紋路或氣泡，可輕輕敲打柱體以消除氣泡，若消除不了則重新裝柱3．對分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。[特別提醒]

洗脫液的流速是影響分離效果的重要因素之一，如果樣品出現渾濁、有沉淀，可離心或過濾后再加樣，洗脫液應維持流速的恒定，即維持洗脫液加在色譜柱上的壓力恒定。[例1]下圖表示對某蛋白質溶液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果(相似于紙層析法分離色素)，下列相關敘述不正確的是(

)A．蛋白質上某些基團解離后可使蛋白質帶電，電場中帶電的蛋白質分子(或多肽)會向著與其所帶電荷相反的電極移動B．蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度完全取決于其所帶凈電荷多少

C．蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度基本取決于相對分子質量的大小D．電泳結果表明溶液中蛋白質可能有兩種，但也可能只有一種[解析]蛋白質的氨基與羧基可發(fā)生解離，使其帶正電或負電，在電場中發(fā)生遷移。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所加的SDS可完全掩蓋蛋白質本身所帶電荷，故其移動速度與本身所帶電荷無關，而由其分子大小決定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳會使蛋白質水解成肽鏈，故結果所示可能只有一種蛋白質(有兩種肽鏈)，也可能是兩種蛋白質。[答案]

B蛋白質在凝膠色譜柱中行進的速度和途徑主要與蛋白質分子的大小相關；在電場中的運動速度和方向除了與蛋白質的分子大小相關外，蛋白質的帶電性質、電量、形狀都影響其在電場中的運動方向和運動速度。[例2]凝膠色譜技術是一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且已經大規(guī)模地用于工業(yè)生產。據圖回答問題：(1)a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是__________，原因是__________。(2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由________________________替代。(3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內不能有氣泡存在，原因是_________________________________。(4)洗脫用的液體應盡量與浸泡凝膠所用的液體________(填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是________________________。(5)若選用SephadexG-75，則“G”表示________，75表示________。[解析]

本題主要考查凝膠色譜法的原理和操作注意事項，可按以下思路進行分析作答。

(1)原理：由于不同蛋白質其相對分子質量不同，相對分子質量較大的蛋白質不能進入凝膠內部通道，只能在凝膠外部移動，路程短，速度快，易洗脫；相對分子質量較小的則進入凝膠內部通道，路程長，速度慢。(2)注意事項：