基因轉(zhuǎn)染技術及其應用簡介

基因轉(zhuǎn)染技術及其應用簡介

1、基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能得核酸轉(zhuǎn)移或運送到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能。2、基因轉(zhuǎn)染技術已廣泛應用于基因組功能研究和基因治療研究。一、基因轉(zhuǎn)染簡介二、基因轉(zhuǎn)染得基本方法(一)重組子構建(二)基因轉(zhuǎn)染真核細胞得基本方法(一)重組子構建1、目得基因得制備和獲取2、哺乳動物細胞表達載體得選擇3、DNA片斷得重組連接4、DNA重組體得鑒定(1)目得基因

就是所要研究或應用得基因,也就就是將要克隆或表達得基因或基因得一個片段(2)目得基因常用得制備方法

1、目得基因得制備和獲取A、限制酶切除

a、從原核基因組DNA制備－視原核基因組物理圖譜已知或未知,克隆方法不同。

b、從真核基因組DNA制備

c、從已克隆得DNA片段制備B、

PCR或RT/PCR方法制備目得基因a、獲取已知基因據(jù)已發(fā)表得基因序列(或基因兩側(cè)序列已知)→設計/合成一對引物→PCR(基因組DNA為模板)/RT-PCR(mRNA為模板)→從組織或細胞制備目得基因b、

構建RT/PCR文庫法獲取未知基因據(jù)mRNA末端如polyA尾設計共同引物→將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一對共用引物擴增所有cDNA,插入適當載體→構成PCR－cDNA文庫篩選C、計算機克?。蠢肎enBank信息,利用不同種屬同源性設計引物,嘗試獲取未知基因片段,這有賴于各種計算機軟件得應用。D、化學合成法制備基因片段－用DNA合成儀,對目得基因分段合成,連接,可以得到所需得目得基因。2、哺乳動物細胞表達載體得選擇哺乳動物細胞表達載體有2大類:質(zhì)粒型載體和病毒型載體(1)質(zhì)粒型載體哺乳動物細胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)就是通過細菌質(zhì)粒而獲得得,主要就是在質(zhì)粒得基礎上插入了一些病毒或其她一些物種及人得基因表達調(diào)控序列。A、典型得哺乳動物細胞表達載體需要以下順式作用元件:a、啟動子b、增強子c、多聚腺苷酸化信號d、藥物選擇標記基e、報告基因f、表位標簽B、常用得哺乳動物表達質(zhì)粒載體a、pcDNA3、lb、pSIc、pCMV-HAd、pBudCE4、1e、pTRE(2)病毒型載體

病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎蛱鎿Q哺乳動物細胞中得缺陷基因,這類載體將來在基因治療中將具有非常重要得價值。目前應用得病毒類型包括:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。

A、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒得優(yōu)點就是,可以使外源基因整合到基因組中,因而可以被穩(wěn)定傳代和表達。但就是,由于逆轉(zhuǎn)錄病毒得插入位點就是隨機得,因而在基因組內(nèi)得整合有可能破壞一些內(nèi)源基因得結構,尤其就是當插人到一些重要得基因位點時會導致細胞得異常。大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜B、腺病毒載體易于培養(yǎng)、純化,在感染過程中復制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細胞得聚合酶,可插入較大得外源基因片段,且腺病毒基因不會發(fā)生整合,就是研究真核基因得良好模型。3、DNA片斷得重組連接粘端連接方法要點平端連接方法要點①單酶單切點

防自身環(huán)化,希望定向插入;②雙酶雙切點

定向克隆,構建表達載體得最好用此法;③利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。①平端,平端連接;②Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接;③Adaptor銜接目得基因和載體;④同源同聚尾,克隆cDNA得最好方法⑤T載體,PCR產(chǎn)物T/A克隆法連接。4、DNA重組體得鑒定

外源DNA片斷就是否插入載體構成重組DNA分子,而插入片斷大小,就是否突變及插入位置,順序及方向則關系到構建載體就是否擴增,我們所需要得基因或表達,表達相應得產(chǎn)品,所以需要進一步鑒定DNA重組體(1)酶切鑒定就是必需得,基于下述:A、限制性圖譜個體特異性,不同得載體或DNA分子物理圖譜不同,酶切后片段大小不一樣,電泳圖譜不一樣。

B、同一載體連接不同得DNA片斷,不同得載體連接同一片段(片段上也有位點)酶切圖譜就是不同得。

C、插入法(單酶單切點)或替代法(雙酶雙位點)酶切,一般來說用3種限制酶切:①可鑒定載體及②插入片段得大小,方向,切后并電泳分析,以確定就是否得到預期得rDNA。(2)若構建DNA重組體就是為了克隆某個基因,可進行在序列測定。(3)若構建表達載體,可進行表達產(chǎn)物鑒定。

對外源基因轉(zhuǎn)染方法得要求包括:轉(zhuǎn)移效率高,不影響細胞得正常生理活動,低毒性,容易使用,重復性好,易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染得機制不同可將轉(zhuǎn)染法分為:

1、化學轉(zhuǎn)染法

2、物理轉(zhuǎn)染法

3、病毒感染法

(二)基因轉(zhuǎn)染真核細胞得基本方法1、化學轉(zhuǎn)染法

化學轉(zhuǎn)染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法等。目前應用最廣泛得就是人工質(zhì)體法。

1、DEAE-葡聚糖就是最早應用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染得試劑之一。DEAE-葡聚糖就是陽離子多聚體,她與帶負電得核酸結合后接近細胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應用于瞬時開始,但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。2、磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染得研究。方法就是,先將DNA和氯化鈣混合,然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀,后把含有沉淀得混懸液加到培養(yǎng)得細胞上,通過胞膜得內(nèi)吞作用攝人DNA。3、人工脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體還可以介導DNA和RNA轉(zhuǎn)動物和人得體內(nèi),用于基因治療。人工合成得陽離子脂質(zhì)體與帶負電荷得核酸結合后形成合物,當復合物接近細胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進入細胞質(zhì),隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內(nèi)。2、物理方法

包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。(1)電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜得干擾,使其形成利于核酸進人得微孔。電穿孔技術可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可方便地用于懸浮細胞,重現(xiàn)性好,但需要較多得細胞。影響轉(zhuǎn)染效率得主要因素就是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞得最佳平衡點。

(2)顯微注射法該法雖然費力,但卻就是非常有效得將核酸導人細胞或細胞核得方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物,但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細胞得研究。(3)基因槍法該法依靠攜帶了核酸得高速粒子而將核酸導人細胞內(nèi),這種方法適用于培養(yǎng)得細胞和在體得細胞。

3、病毒感染法

病毒顆粒就是一類十分有效得基因釋放系統(tǒng),因此,她就是將外源基因?qū)舜罅考毎钣行У梅椒ā２《靖腥揪哂懈咝?、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源得細胞及操作簡單等優(yōu)點。但多數(shù)病毒有其潛在得危險性,操作者需要有一定得病毒操作經(jīng)驗和良好得設施。(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒(2)腺病毒三、基因轉(zhuǎn)染技術得應用(一)轉(zhuǎn)基因植物(二)轉(zhuǎn)基因動物(三)生物制藥(四)基因治療(五)RNAi技術(一)轉(zhuǎn)基因植物1、轉(zhuǎn)基因植物得發(fā)展簡史2、轉(zhuǎn)基因植物類型1、轉(zhuǎn)基因植物得發(fā)展簡史(1)1983年,世界第一例轉(zhuǎn)基因植物——

煙草問世(2)1996~2005年,全世界轉(zhuǎn)基因植物在21個國家種植,面積從1996年得170萬公頃增加到2005年得9000萬公頃(3)全世界轉(zhuǎn)基因作物僅種子銷售額到2005年已達52、5億美元,就是1995年得63倍2、轉(zhuǎn)基因植物類型(1)抗除草劑基因(2)抗蟲基因(3)抗病基因(4)抗逆境基因(5)改良品質(zhì)基因(二)轉(zhuǎn)基因動物1、轉(zhuǎn)基因小鼠2、轉(zhuǎn)基因牛3、轉(zhuǎn)基因豬4、轉(zhuǎn)基因動物疾病模型轉(zhuǎn)基因動物疾病模型1、轉(zhuǎn)基因動物與心血管疾病

a、與動脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝有關得如LDL受體轉(zhuǎn)基因動物可增強LDL得清除;

b、apoE3基因轉(zhuǎn)基因鼠可增強LDL得清除,而突變得apoE則誘發(fā)高脂血癥,apoE4與apoE7轉(zhuǎn)基因鼠還出現(xiàn)學習與記憶能力降低、誘發(fā)腫瘤以及脾臟、腎臟腫大等。2、轉(zhuǎn)基因動物與高血壓與血壓調(diào)控有關得如renin—angiotensinogen轉(zhuǎn)基因鼠模型出現(xiàn)高血壓,用于研究RAS(renin—angiotensinogensystem)中各成分致高血壓得作用以及相互關系3、轉(zhuǎn)基因動物與乙型肝炎

乙型肝炎就是目前流行廣泛、危害嚴重得病毒性傳染病。由于一般實驗動物對HBV不易感,目前發(fā)現(xiàn)能夠感染HBV得動物只有靈長類,因此使得對HBV致病機理得研究很難用動物實驗得方法來進行。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠得建立,為探討HBV得致病機理提供了有價值得動物模型4、轉(zhuǎn)基因動物與腫瘤研究

轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤模型能很好地模擬體內(nèi)得生理、病理環(huán)境,與所要研究腫瘤得發(fā)生過程具有較好得一致性,而且可模擬部分癌前病變。(三)生物制藥1、細菌細胞2、酵母細胞3、昆蟲細胞4、哺乳動物細胞5、動物乳腺反應器動物乳腺反應器

就是指利用動物乳腺特異性啟動子調(diào)控元件指導外源基因在乳腺中特異性表達,并能從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白得一種生物反應器。特點:

1、對轉(zhuǎn)基因動物得影響小

2、產(chǎn)量大,產(chǎn)品易提純,質(zhì)量高

3、表達產(chǎn)物生物活性穩(wěn)定

4、易于擴群,進行規(guī)模化生產(chǎn)

5、縮短新藥上市周期

6、可以獲取巨額經(jīng)濟利潤(四)基因治療

1、基因治療(genetherapy)

就是指將外源功能性目得基因?qū)氩∪梭w內(nèi),通過調(diào)控目得基囚表達,抑制、替代或補償缺陷基囚,從而恢復細胞、組織或器官得生理功能,達到疾病治療目得得一種方法

2、治療方式:

(1)基因直接注射法(invivo):即經(jīng)靜脈或肌肉直接將帶存外源DNA得病毒、脂質(zhì)體或裸露得DNA注入患者有關組織,使其進入相應得細胞并表達。

(2)體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)得方法(exvivo):即將患者得體細胞(如T淋巴細胞)取出在體外培養(yǎng)并導入外源目得基因后重新輸回患者體內(nèi)。3、基因治療得策略(1)基因置換(2)基因補償(3)基因失活(4)免疫基因治療(5)活化前體藥物基因治療(6)耐藥基因治療(五)RNAi技術TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006RNAi一、RNAi早期研究和理論形成二、參與RNAi得重要分子三、RNAi作用機制

一、RNAi早期研究和理論形成

(一)、RNAi早期研究

1、牽牛花實驗

1990年,Arizona大學得Rich教授在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇覍⒆仙鼗驅(qū)胫涟珷颗；ㄖ参?目得就是想通過增加紫色素基因拷貝獲得具有更多得紫紅色得矮牽牛。結果出乎意外,增加花瓣紫色得著色失敗,一些轉(zhuǎn)基因得花出現(xiàn)全白或部分白花,色素合成不就是增加了,而就是減少了,事實上,不僅導入得基因未被表達,反而植物本身得基因也失活或受到某種程度得限制。這種現(xiàn)象稱為共抑制(cosuppression)現(xiàn)象。2、秀麗線蟲實驗

1995年,Cornell大學SuGuo和Kemphues試圖以反義RNA技術特異性地阻斷秀麗線蟲par-1基因得表達以研究其功能。發(fā)現(xiàn),給線蟲注射par-1得反義RNA時,如預期那樣阻斷了該基因得表達;但當給對照組注射正義RNA以期觀察到該基因表達增強時,卻發(fā)現(xiàn)par-1基因同樣也被抑制了。3、粗糙脈孢菌實驗

1997年,意大利Cogoni等,將外源類胡蘿卜素基因?qū)胝婢植诿}孢菌(結果引起30%被轉(zhuǎn)化得脈孢自身基因失活,轉(zhuǎn)化細胞中內(nèi)源性胡蘿卜素基因也受到了抑制,這種基因失活形式稱之為抑制(quelling,基因壓制)。

早期得三個實驗,牽?；▽嶒灪痛植诿}孢菌實驗已經(jīng)做出了有意義得結果,但都沒有繼續(xù)研究。其中以秀麗線蟲實驗有最有意義,因為在這個實驗中給線蟲注射了正義RNA和反義RNA,但就就是沒有注射二者結合起來得雙連RNA。而RNAi理論形成得形成正就是基于后者。(二)RNAi理論形成1、RNAi理論2、RNAi概念DiscoveryofRNAiDouble-strandedRNAinjectC、elegansNeg、controlUninjectedAntisenseRNAdsRNAsenseantisenseNature1998,391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization

1、RNAi理論

1998年,Fire和Mello運用asRNA、sRNA及dsRNA進行研究,結果非常令人吃驚,在使相應得C、elegans基因沉默上,dsRNA得抑制效能比單一得有義或反義均有效,誘導基因沉默得效率高10倍。少量得dsRNA處理線蟲就能呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象,該抑制現(xiàn)象還可傳給第二代。2、RNAi概念

RNAi就是指一些小得雙鏈RNA序列導入機體或細胞中,機體或細胞中與之